Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及診斷價值

張 琳,陳 晨,于藝冰,宋 輝,郭媛媛,李峰敏

(秦皇島市第一醫院 血液科,河北 秦皇島066000)

彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)為非霍奇金淋巴瘤中常見的組織學疾病，生長速度快，異質性與侵襲性強，其異質性主要表現在組織學類型、分子遺傳、臨床表現等方面[1]。目前DLBCL的發病機制尚不明確，且治療后極易復發，病情進展快，故臨床尋找發病機制十分重要[2]。Bcl-2為參與凋亡調控的因子，與淋巴瘤的發生相關[3]。研究顯示[4]，miR-26a在肝癌、結直腸癌、膀胱癌等腫瘤中具有抑癌作用，在肺癌中具有促進腫瘤轉移作用，miR-26a在DLBCL中表達低于B淋巴細胞。AXL(Anexelekto)最早發現于白血病，與腫瘤的侵襲轉移相關，可預測生存率[5]。為此，在本文研究中分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在DLBCL中的表達，并分析三者與DLBCL的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年6月-2021年6月秦皇島市第一醫院血液科歸檔的資料完整的85例DLBCL患者作為研究組，另外選取85例淋巴結反應增生患者為對照組。研究組男42例，女43例，年齡16-72歲，平均(41.82±27.85)歲。對照組男40例，女45例，年齡15-73歲，平均(42.05±28.11)歲。本次研究所有DLBCL患者均知情同意，且簽署了知情同意書。

納入標準：研究組患者符合《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷與治療指南》[6]中對于彌漫大B細胞淋巴瘤的診治標準，患者病灶可進行測量，患者為首次發病。

排除標準：患者心肝腎功能不全，患者處于妊娠哺乳期，患者腫瘤侵犯中樞神經系統，患者有淋巴瘤病史，患者精神狀態異常。

1.2 檢測方法

1.2.1Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL檢測 采用免疫組化法檢測所有患者體內Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表達水平，采集患者淋巴組織，使用10%甲醛溶液進行固定，石蠟包埋，后添加二甲苯進行石蠟脫化，使用0.3%H2O2對組織內過氧化物酶進行降解，并使用PBS沖洗后進行封閉處理，加入稀釋后一抗過夜，后倒去作用液，用PBS清洗5 min，加入二抗，放于37℃下30 min，進行清洗，加入甘油進行封皮，隨機選取10個高倍視野顯微鏡下觀察結果，陽性表現主要為細胞核與細胞質染為黃色與棕黃色，陰性未被染色，對陽性細胞所占比例與染色強度乘積評分，0分為顯微鏡下觀察10個高倍視野陽性細胞所占比例≤5%，1分為6%-25%，2分為26%-50%，3分為≥51%，0分為無著色，1分為淺著色，2分為著棕黃色，3分為著棕褐色，陽性細胞所占比例與染色強度乘積0分為(-)，1-4分為(+)，5-8分為(++)，9-12為(+++)。

1.2.2Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表達水平檢測

采用實時熒光定量法檢測Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表達水平，提取樣本RNA，使用高速離心機，將細胞原液放于15 ml離心管，離心處理后棄去上清，使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理獲得總cDNA后使用Primer5.0設計進行引物序列，啟動PCR儀，反應體系：20 μl，反應條件：95℃ 15 min，94℃變性30 s、60℃退火延伸34 s，共進行40個循環，采用2-△△Ct方法計算出Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表達量。Bcl-2上游引物序列：5’-CAGCCTTGAAACATTGATGG-3’，下游引物序列：5’-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3’；miR-26a-5p上游引物序列：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATCCAGGA-3’，下游引物序列：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；p-AXL上游引物序列：5’-ACGCATGAGCCGAAGCTAAC-3’，下游引物序列：5’-AGGGACCCTTAGGCCATTGT-3’；內參U6引物序列：上游：5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，下游：5’-GCATTTGGTGGTATTGGG-3’。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 Bcl-2、miR-2 6a-5p、p-AXL在DLBCL中的表達

如表1所示，與對照組相比，研究組中Bcl-2、p-AXL表達量升高，miR-26a-5p表達量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在DLBCL中的表達

圖1 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在對照組、研究組中的表達免疫組化圖(×200)

2.2 研究組患者Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表達水平與病理參數的關系

如表2所示，Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表達水平與DLBCL患者性別、年齡、B癥狀無關，與患者原發部位、免疫表型、Ann-Arbor臨床分期、乳酸脫氫酶、IPI評分、結節累及、Ki-67指數有關，非生發中心來源、Ann-Arbor分期為Ⅲ-Ⅳ期、乳酸脫氫酶>245 U/L、IPI評分3-5分、結節累及≥2處、Ki-67指數≥75%，DLBCL患者Bcl-2、p-AXL表達水平升高miR-26a-5p表達水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 研究組患者Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表達水平與病理參數的關系

2.3 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL之間相關性分析

如圖2所示，Bcl-2、miR-26a-5p呈負相關(r=-0.532，P=0.001)；Bcl-2、p-AXL呈正相關(r=0.607，P=0.001)；miR-26a-5p、p-AXL呈負相關(r=-0.533，P=0.001)。

圖2 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL之間相關性分析

2.4 ROC曲線分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL對DLBCL的診斷價值

如表3、圖3所示，ROC曲線顯示，與Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL單項診斷相比，三項聯合對DLBCL的診斷價值較高(P<0.05)。

表3 ROC曲線分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL對DLBCL的診斷價值

圖3 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL診斷DLBCL的ROC曲線

3 討論

臨床研究顯示，淋巴瘤發病時淋巴結可快速增大，且伴有淋巴結外病與骨髓侵犯。腫瘤的發生與發展涉及多種因素，基因的異常表達在腫瘤的發生與發展有重要作用[7-8]。

原癌基因Bcl-2存在于細胞中線粒體核膜、外膜孔粗面內質網上，是一種膜蛋白，可使細胞的凋亡受到抑制，并調節B細胞的發育與分化[9-10]。研究表明[11-12]，45%DLBCL患者體內Bcl-2處于高表達，Bcl-2基因與免疫球蛋白融合，可導致患者預后不佳。Bcl-2過度表達會抑制細胞株凋亡，且可調控組織細胞凋亡，使組織中細胞凋亡與增殖失衡，導致對化療不敏感[13]。本文研究顯示，Bcl-2在DLBCL患者體內表達升高，且其表達隨著Ann-Arbor分期而升高，其原因可能為Bcl-2基因改變腫瘤細胞生物學行為，使患者表現出不同癥狀。

miR-26a-5p在多種腫瘤中具有抑癌作用，在結直腸癌低表達，為診斷結直腸癌的新型生物標志物[14]。有研究表明[15]，miR-26a-5p表達下調可經誘導上皮間質轉化，使肝癌轉移，并使患者的預后受到影響，miR-26a-5p在膀胱癌組織中低表達，上調其miR-26a-5p可抑制其癌細胞的遷移與侵襲，且miR-26a-5p在前列腺中表達降低，前列腺細胞的遷移、侵襲受到其影響。miR-26a-5p可通過不同的靶基因調控不同的信號通路，發揮其對癌細胞的抑制或促進作用[16]。從表1可以看出，miR-26a-5p在患者DLBCL患者體內表達降低，且與患者的Ann-Arbor分期負相關，因此可作為為DLBCL發展的標志。

AXL蛋白屬于受體酪氨酸激酶家族中的一員，與其他抗體結合為肺癌、乳腺癌等疾病的預后不良標志物，AXL參與肉瘤的發生與發展，并可促進骨肉瘤細胞的侵襲與轉移[17]。AXL可通過激活AKT信號通路介導腫瘤細胞的耐藥性，AXL在食管癌細胞中高表達可使患者產生耐藥性。研究表明[18]，腫瘤細胞可通過釋放活性氧促進Gas6分泌，與AXL結合，促進腫瘤的發生發展。本文研究發現，p-AXL高表達與DLBCL患者，且與患者的免疫表型、Ann-Arbor分期等病理參數相關。另外本文采用相關性分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL與DLBCL之間的關系，提示Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL可能共同參與此病的發生進展，但本文并未深入分析其具體作用機制，因此本文結果還需后續研究進一步分析，以明確Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL參與DLBCL的作用機制，為臨床上此病的診治提供參考。

綜上所述，Bcl-2、p-AXL在DLBCL患者表達中升高，miR-26a-5p在患者中表達降低，推測Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL可能共同參與此病的發生發展。