酶聯免疫吸附法和實時熒光定量PCR法檢驗EB病毒的效果比較

張繽月

(吉林省一汽總醫院 檢驗科,吉林 長春130011)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)為具傳染性單核細胞增多癥病原體，與鼻咽癌、兒童淋巴瘤發生發展密切相關[1]。該病主要通過唾液傳播，一般發生于幼兒，經口咽上皮細胞增殖后，引發B淋巴細胞感染，后進入血液循環引發全身性感染，急性期主要表現為咽炎、發熱、淋巴結炎等上呼吸道感染癥狀，急性期后會持續發生低熱、疲勞等癥狀，尤其免疫缺陷者感染EB病毒后死亡風險較高，因此需盡早鑒別診斷，并實施針對性治療，以快速改善患者臨床癥狀，保障其生命安全[2-3]。實施熒光定量PCR為該病主要診斷辦法，診斷準確度高，屬臨床診斷金標準，但此種診斷方案對儀器設備要求較高、診斷用時較長，影響臨床診斷需求[4]。酶聯免疫吸附法(ELISA)，指利用酶法標記抗原或抗體，以檢測相應抗原或抗體的免疫學標記技術，具靈敏性強、特異性高、重復性好等特點，同時可滿足臨床快速、大量檢出特性，但在EB病毒檢驗中，此種檢驗方法是否與實施熒光定量PCR具相同診斷價值研究較少[5]。為此，本次研究選吉林省一汽總醫院2020年1月至2021年8月期間110例上呼吸道感染患者為研究對象，均應用上述兩種方案檢驗，分析兩種檢驗結果差異性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選吉林省一汽總醫院2020年1月至2021年8月期間110例兒科上呼吸道感染患者為研究對象，其中男性57例、女性53例，年齡16 d-12歲，平均(4.97±1.12)歲。

1.2 主要試劑

①人血DNA提取試劑盒(購自Omega公司)；②人外周血淋巴細胞分離液(購自中國天津灝陽)；③ELISA試劑盒中，EB病毒殼抗原(VCA)IgG檢測試劑盒、EB-VCA-IgM抗體試劑盒、EB病毒早期抗原(EA)IgG試劑盒、EB病毒核抗原(NA1)IgG抗體檢驗試劑盒均購自北京貝爾。

1.3 方法

1.3.1實時熒光定量PCR檢驗 ①樣本準備：采集患者2 ml血液樣本，裝于枸櫞酸抗凝試管中，-4℃儲存備用；取1 ml抗凝血，加1 ml無菌生理鹽水，混勻后，加1 ml人外周血淋巴細胞分離液，水平離心，700 g離心20 min；取單個細胞層，轉移至無菌室管中，17 000 g離心10 min，棄上清，留沉淀，加50 μl DNA提取液，混勻，恒溫處理(100℃，10 min)，復溫后1 700 g離心5 min，取上清(模板)備用；(2)實施熒光定量PCR擴增：取2 μl上清液，加入PCR反應緩沖液，準備PCR擴增；實時熒光定量PCR檢測EBNA1、BZLF1水平，擴增反應體系：2×SYBR Green Master Mix 5 μl，EBNA1、BZLF1基因上下游引物及逆轉錄產物分別為0.5 μl、2.5 μl，ddH2O 1.5 μl；反應條件：預變性(95℃，2 min)、變性(95℃，2 min)、退火(60℃，15 s)、延伸(72℃，30 s)，共進行40個循環，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.3.2ELISA法檢驗 采集患者2 ml靜脈血加至促凝管中，靜止沉淀30 min，分離血清。嚴格依據試劑盒說明書要求操作，進行EB抗體、抗原檢驗，并設置陽性、陰性、臨界對照實施室內質量控制。

1.4 觀察指標

(1) 統計比較實時熒光定量PCR及ELISA法的EB病毒陽性檢出率[6]：①實時熒光定量PCT陽性標準：Ct值在13-35之間，出現S型曲線，且溶解曲線為單一峰值，即為陽性，否則則為陰性；②實時熒光定量PCR對EB病毒分期檢出情況：病毒活動性感染：EBNA1、BZLF1均為陽性；潛伏期感染：EBNA1陽性，BZLF1陰性；未感染：EBNA1、BZLF1均為陰性；②ELISA[7]：經試劑盒檢驗后，計算待測樣本A值與臨界指控物A比值；陽性：比值>1.1；陰性：比值<0.8；可疑弱陽性：0.8≤比值≤1.1；若為弱陽性，則在2周后重新采集樣本檢驗。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR檢驗中EB病毒陽性檢出率情況

經熒光定量PCR檢驗中，EBV-DNA陽性檢出率為50.91%(56/110)，其中EB病毒活動性感染占比為20.00%(22/110)、潛伏期感染占比為30.91%(34/110)。

2.2 EB病毒活動性感染中ELISA檢驗結果

22例EBV-DBA陽性患者中，經ELISA檢驗，EB-VCA-IgM陽性率為95.45%(21/22)、100.00%(22/22)，與EBV-DNA陽性檢出率相近(P>0.05)；EB-NA1-IgG、EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG陽性檢出率分別為68.18%(15/22)、77.27%(17/22)、72.73%(16/22)，較EBV-DNA陽性檢出率低(P<0.05)，見表2。

表2 EB病毒活動性感染中ELISA檢驗結果[n(%)]

2.3 EB病毒潛伏期感染中ELISA檢驗結果

34例潛伏期感染患者中，經ELISA檢驗，EB-NA1-IgG陽性率分別為94.12%(32/34)，與EBV-DNA潛伏期感染檢出率相近(P>0.05)；EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG、EB-VCA-IgM陽性檢出率為82.35%(28/34)、88.24%(30/34)、82.35%(28/34)，較EBV-DNA潛伏期檢出率低(P<0.05)，見表3。

表3 EB病毒潛伏期感染中ELISA檢驗結果[n(%)]

3 討論

EB病毒屬皰疹病毒科嗜淋巴細胞病毒屬，基因組成為DNA。人類為EB病毒感染宿主，無癥狀感染多發生于幼兒[8]。EBV致病機制多樣化，在感染人體后，主要以兩種形式存在，即病毒活動性感染期、潛伏感染期。病毒活動性感染期時，病毒以線性分子形式插入宿主細胞DNA中，通過復制、轉錄、翻譯過程，完成病毒顆粒裝配，并在病毒干擾下引發細胞裂解，引發相關臨床癥狀。潛伏感染期以換裝分子游離于細胞DNA外，持續性存在于細胞中，并隨細胞正常分裂，不釋放病毒顆粒，因此不會表現出明顯臨床癥狀。當潛伏感染期病毒經外界或內在因素刺激后，如其它病原菌感染、免疫機能下降、上皮組織損傷等情況時，潛伏感染期病毒基因組會被激活，誘發增殖性感染期，誘發相關臨床癥狀。而兒童多具免疫能力低下、易發生上呼吸道感染性疾病等特點，且一般尚未養成良好衛生習慣，因此其EB病毒感染風險相對較高[9]。

王燁[10]在對廈門市兒童EB病毒感染情況調查分析中發現，經實時熒光定量PCR診斷，EB病毒陽性率為71.79%，說明兒童EB感染率較高；此類患兒主要臨床表現為急性扁桃體炎、肺炎、單核細胞增多癥、中性粒細胞減少癥、輕度貧血、電解質文寬等，主要臨床表現為發熱、淋巴結腫大、扁桃體腫大等癥狀，且病毒載量高，臨床癥狀更嚴重。說明在兒童上呼吸道感染患兒中，EB病毒感染為常見病因。除上呼吸道感染癥狀外，炎癥性腸病患者同樣存在EB病毒感染情況，且癥狀嚴重患者EB病毒陽性檢出率顯著提升[11-12]。說明在呼吸道黏膜、消化道黏膜感染性疾病中，EB病毒感染占比較高。若患者已經存在呼吸系統疾病，則在發生EB病毒感染后，會引發病癥急性加重[13]。張正玲[14]在對156例慢阻肺急性加重期患者研究中發現，EB病毒感染患者炎癥反應更嚴重，且在其治療中，抗感染治療時間明顯延長，并發癥發生率顯著增加，重癥病房入住率顯著增加，血氣指標恢復速度更緩慢。相關研究表示[15]，在對鼻型結外自然殺傷(NK)/T細胞淋巴瘤患者治療中，若存在EB病毒感染，該病客觀緩解率顯著下降，而接受抗EB病毒治療后，客觀緩解率顯著上升，說明說明EB病毒感染不僅會引發呼吸系統感染性疾病，同時會加重原有感染性疾病嚴重程度、加重患者淋巴結刺激，影響患者免疫功能，進而影響治療效果，威脅患者生命安全，需盡早診斷評估，分析患者是否存在EB感染并實施抗EB病毒治療，以改善預后。

目前在對EB病毒臨床檢驗中，主要檢驗方案為實時熒光定量PCR技術檢驗。此種檢驗技術主要依靠病毒DNA水平實施檢驗，通過采集患者血液樣本、唾液樣本等，提取樣本中病毒細胞DNA后，通過設計引物、擴增特定DNA片段等后，對特定片段進行熒光定量，以判定在檢驗中是否出現特定DNA片段，進而可實現基因水平臨床診斷[16]。與傳統定量PCR辦法相比，實施熒光定量PCR技術有效解決了只能終點檢測的局限性，可將每一輪循環中均進行熒光信號檢測，將其記錄在電腦軟件中，并通過標準曲線獲得定量結果。同時實施熒光定量PCR在樣品Ct值計算中，Ct值重現性PCR循環在Ct值所在循環數時，剛剛進入指數擴增期，此時微小誤差尚未方法，此時Ct值重現性極好，得到恒定Ct值，使檢驗結果更準確[17]。但在其臨床檢驗中，因上呼吸道感染患者數量較多，且以兒童上呼吸道感染最為常見，因此在臨床相關指標檢驗中，主要檢驗需求為檢查結果準確度高、檢出速度快，但實時熒光定量PCR診斷中，診斷用時相對較長，難以滿足臨床快速檢出需求；且對診斷操作人員專業技術要求較高；同時應用此種檢驗辦法臨床檢驗中，對儀器設備要求較高，基層醫療機構難以實現此種檢驗方案檢驗，因此在臨床診斷中，應用實時熒光定量PCR檢驗難以滿足臨床診斷需求。

ELISA檢驗中，主要原理為通過將抗體、抗原結合至某種固體相載表面，保持其免疫活性，并與相對應的抗原或抗體與特定酶相連，形成酶標抗體或酶標抗原，在保留酶抗體或抗原活性同時，保留了酶活性信號，在加入酶反應底物后，會經酶反應粗話為有色產物；而酶標抗原、酶標抗體量的多少，會出現不同程度顏色變化[18-19]。此種檢驗辦法具診斷靈敏度高、特異性好、重復性好、檢出速度快等特點，應用試劑盒即可快速、大量完成檢驗結果，為目前臨床常用檢驗方案[20]。但在其臨床診斷中，存在抗原、抗體可檢測范圍局限性影響，在診斷中，若抗原或抗體數量較少，則應用ELISA檢驗存在一定漏診風險。

本次研究中，對EB病毒進行實時熒光定量PCR、ELISA兩種方法檢驗，并進行兩種檢驗方法檢驗結果比較分析，分析ELISA在對EB病毒檢驗中能夠替代實時熒光定量PCR檢驗的可能性。在研究結果中顯示，經熒光定量PCR檢驗中，EBV-DNA陽性檢出率為50.91%(56/110)，其中EB病毒活動性感染占比為20.00%(22/110)、潛伏期感染占比為30.91%(34/110)，說明110例患兒上呼吸道感染靜脈血中，確定EB病毒感染占比超過50%，說明在兒童上呼吸道感染中，EB病毒感染率較高。在對兩種檢驗方案比較分析中發現，22例EBV-DBA陽性患者中，經ELISA檢驗，EB-VCA-IgM陽性率為95.45%(21/22)、100.00%(22/22)，與EBV-DNA陽性檢出率相近(P>0.05)；EB-NA1-IgG、EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG陽性檢出率分別為68.18%(15/22)、77.27%(17/22)、72.73%(16/22)，較EBV-DNA陽性檢出率低(P<0.05)，考慮原因為，VCA-IgG、NA1-IgG、VCA-IgM、EA-IgG均為EB病毒常見ELISA檢驗項目，EBV殼抗原(VCA)抗體IgM在發病早期會迅速升高，但在感染數周后消失，為EBV急性感染期重要標志，一般在出現明顯臨床癥狀后，其血清水平會迅速上升，因此多用于感染后早期診斷[21-22]；在本次研究中，經實時熒光定量PCR檢驗中處于病毒活動性感染患兒，其EB-VCA-IgM陽性檢出率較高，且陽性檢出率與實時熒光定量PCR結果相近，說明在兒童急性上呼吸道感染致病菌中，存在EB病毒感染情況。正常情況下，EB-NA1-IgG陽性、EB-NA1-IgG陽性、EB-VCA-IgG陽性狀態下，提示患者出現過遠期感染情況，并非現行感染癥狀，在本次研究中，患兒EB-NA1-IgG、EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG陽性檢出率均較實時熒光定量PCR低，提示部分患兒存在既往EB病毒感染情況。因此在臨床診斷中，若出現上呼吸道感染癥狀，且經ELISA檢查出現EB-VCA-IgM陽性檢出率明顯升高情況，提示患兒處于EB病毒活動性感染期，需在基礎治療上增加抗EB病毒治療方案，包括提升患兒免疫力治療等，以保證治療效果[23]。同時也可以說明，在對上呼吸道感染患兒臨床檢驗中，實時熒光定量PCR檢查結果處于病毒活動性期時，EB-VCA-IgM表現出良好一致性，可用于臨床診斷篩查。

本次研究結果顯示，34例潛伏期感染患者中，經ELISA檢驗，EB-NA1-IgG陽性率分別為94.12%(32/34)，與EBV-DNA潛伏期感染檢出率相近(P>0.05)；EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG、EB-VCA-IgM陽性檢出率為82.35%(28/34)、88.24%(30/34)、82.35%(28/34)，較EBV-DNA潛伏期檢出率低(P<0.05)，考慮原因為，正常情況下，若患兒經ELISE檢驗中EB-NA1-IgG為陽性，提示患兒存在遠期EB病毒感染史，因此患兒血清中出現相應抗體，或說明患兒正處于EB病毒潛伏期；而處于EB病毒感染潛伏期狀態下，易受免疫力下降、相關功能損傷而出現EB病毒被激活情況，因此在對呼吸道感染患兒臨床診斷中，若出現EB-NA1-IgG陽性升高情況，需積極治療原發病，并持續監控患兒EB病毒表達情況，避免EB病毒被激活影響治療效果。而在研究結果中顯示，EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG、EB-VCA-IgM陽性檢出率較實時熒光定量PCR稍低，其中EB-VCA-IgM陽性率下降，可排除患兒處于EB病毒感染活動期，但EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG陽性檢出率下降，考慮原因可能與EB病毒感染史后患兒并未產生相應病毒抗體相關，或與實驗室ELISA檢查質量相關[24-25]。因此在對兒童上呼吸道感染EB病毒檢驗中，實時熒光定量PCR檢驗中患兒處于EB病毒感染潛伏期，則應用EB-VCA-IgG檢驗可獲得相近檢出效果，說明在臨床檢驗中，可通過EB-VCA-IgM、EB-VCA-IgG水平評估患兒EB病毒感染狀態。

綜上，本次研究結果顯示，在實時熒光定量PCR檢驗中，處于病毒活動期感染時，EB-VCA-IgM表現出良好診斷符合率；在處于EB病毒潛伏感染期時，EB-NA1-IgG表現出診斷一致性。但在診斷中仍存在一定漏診率，因此必要時建議應用ELISA聯合實時熒光定量PCR檢驗，以保證臨床檢驗質量。