止咳片質量標準提升研究*

劉 超，喻貴英，羅 偉，昌秦芬，汪 楊，蔣 靜，謝元碧

（太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司，重慶 401336）

止咳片為潤肺定喘、祛痰止咳的良藥，由百部、前胡、苦杏仁組方，臨床主要用于治療咳嗽、痰多、氣喘，以及小兒百日咳、急慢性氣管炎，療效確切。其藥品質量標準收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第四冊）》（標準編號WS3?B ?0700 ?91），但僅含性狀鑒別、理化鑒別、前胡薄層鑒別和檢查項，質量控制指標少。百部作為止咳片組方中的君藥，其味苦、微甘，性微溫，歸肺經，具有潤肺止咳、殺蟲滅虱的功效。百部藥材為百部科植物直立百部Stemona sessilifolia（Miq.）Miq.、蔓生百部Stemona japonica（BL.）Miq.或對葉百部Stemona tuberosaLour.的干燥塊根［1］。系統對比發現，我國百部屬植物塊根中的總生物堿含量、百部生物堿含量因其品種、產地的不同而有所差異［2］；直立百部與蔓生百部較相似，兩者均與對葉百部差異較大［3?5］。為更有效控制止咳片質量，本研究中基于文獻［1，6］，進一步對百部進行高效液相色譜（HPLC）圖譜研究。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ML ?304T 型精密電子天平（梅特勒?托利多儀器＜上海＞有限公司）；KQ ?600DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS ?24 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；ZF ?90 型多功能暗箱式紫外投射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；QYSW ?10A型超純水機（重慶前沿水處理設備有限公司）；HP ?1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試藥

止咳片（桐君閣藥廠，編號為1～10）；對葉百部對照藥材（批號121221 ?201604），直立百部對照藥材（批號121588 ?201502），苦杏仁苷對照品（批號110820 ?201808，含量88.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠，規格為100 mm ×200 mm、厚0.20～0.25 mm）；氫氧化鈉硅膠G 薄層板（自制）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為一級純化水。蔓生百部藥材、對葉百部藥材均購自西藏本草真源中藥資源有限公司，由重慶太極實業（集團）股份有限公司楊修齊副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 HPLC 圖譜研究

2.1.1 蔓生百部、直立百部

蔓生百部、直立百部對照藥材溶液制備：取蔓生百部藥材、直立百部對照藥材粉末各1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加氨試液4 mL，放置30 min，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

對葉百部對照藥材溶液制備：取對葉百部對照藥材粉末1 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，加氨試液4 mL，放置30 min，再加入異丙醇?甲醇（1∶1，V/V）溶液25 mL，超聲（功率300 W，頻率50 kHz，下同）處理30 min，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取濾液，濾渣重復提取1 次，合并濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

色譜條件：色譜柱為Agilent ShimNex WR Phenyl-Hexyl 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%三乙胺溶液?乙腈（68∶32，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為306 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。

特征峰獲取：取上述3 種對照藥材溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜（見圖1）。結果蔓生百部藥材和直立百部對照藥材溶液的HPLC 圖譜特征峰清晰，分離良好，而對葉百部對照藥材溶液的HPLC圖譜特征峰不明顯。結果表明，該色譜條件僅適用于蔓生百部及直立百部圖譜的特征峰獲取。

2.1.2 對葉百部及樣品

1）對葉百部

色譜條件：色譜柱同2.1.1 項，流動相為0.1% 三乙胺溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min 時90%A →60%A，10～20 min時60%A →50%A，20～40 min時50%A →25%A），蒸發光檢測器（漂移管溫度105 ℃，氣流量3.0 mL/ min），流速為1.0 mL/ min，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL。

特征峰獲取：取對葉百部對照藥材溶液適量，按2.1.2 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。對葉百部對照藥材溶液HPLC 圖譜中3 個特征峰的相對保留時間及可變范圍見表1；以峰3（對葉百部堿）為指標成分峰。

表1 對葉百部3個特征峰的相對保留時間及可變范圍Tab.1 Relative retention time and variable range of the three characteristic peaks in Stemona japonica

1.原百部堿A.對葉百部對照藥材溶液 B.蔓生百部對照藥材溶液 C.直立百部對照藥材溶液圖1 3種對照藥材高效液相色譜圖1.ProtostemonaA.Reference medicinal materials of Stemona japonica B.Reference medicinal materials of Stemona sessilifolia C.Reference medicinal materials of Stemona tuberosaFig.1 HPLC chromatograms of three reference medicinal materials

2）樣品

溶液制備：取對葉百部藥材樣品適量，按2.1.1 項下對葉百部對照藥材溶液制備方法制得藥材樣品溶液。取樣品粉末2.5 g，精密稱定，置具塞瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，以70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液1。按止咳片工藝和處方制備缺百部的陰品樣品，同供試品溶液1 制備方法制得陰性對照品溶液。

特征峰獲取：取上述3 種溶液及2.1.1 項下對葉百部對照藥材溶液，按2.1.2 項下色譜條件進樣測定，結果表明對照藥材溶液、藥材樣品溶液和樣品溶液的HPLC 圖譜雖基本一致，但該色譜條件不適用于對葉百部藥材及制劑的質量控制。詳見圖2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇?水（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇，制成每1 mL 含98.96 μg 苦杏仁苷對照品溶液。取樣品20 片，除去包衣，研細，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液2。

2.2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：取2.2.2 項下2 種溶液及2.1.2 2）項下陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數以苦杏仁苷峰計不低于5 000，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，陰性對照無干擾，專屬性良好。詳見圖3。

線性關系考察：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液4，6，8，10，12，15，20 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以對照品進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得苦杏仁苷回歸方程Y=945.488 4X?6.959 9（r=0.999 98，n=7）。結果表明，苦杏仁苷進樣量在0.395 84～1.979 20 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

1.對葉百部堿A.對照藥材溶液 B.藥材樣品溶液 C.供試品溶液1 D.陰性對照品溶液圖2 對葉百部藥材及制劑的高效液相色譜圖1.TuberostemonineA.Solution of reference medicinal materials B.Sample solution of medicinal materials C.Test solution 1 D.Negative reference substanceFig.2 HPLC chromatograms of medicinal materials and preparations of Stemona tuberosa

1.苦杏仁苷A.對照品溶液 B.供試品溶液2 C.陰性對照品溶液圖3 止咳片的高效液相色譜圖1.AmygdalinA.Reference solution B.Test solution 2 C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Zhike Tablets

儀器精密度及中間精密度試驗：精密吸取苦杏仁苷對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積，結果的RSD為0.11%（n=6），表明儀器精密度良好；3 名試驗人員分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為0.07%（n=3），表明中間精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，室溫下放置0，3.5，7.0，10.5，14.0，17.5，21.0，24.5 h 時，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.73%（n =8），表明室溫下供試品溶液放置24.5 h 內穩定。

重復性試驗：取同一供試品溶液6 份，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算苦杏仁苷含量。結果苦杏仁苷含量的平均值為5.585 mg/g，RSD為0.42%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批樣品粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，精密加入150.0 μg/ mL 苦杏仁苷對照品溶液10 mL，混勻，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取10 批樣品各適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算苦杏仁苷含量。結果苦杏仁苷含量為每片0.34～1.66 mg，平均0.95 mg。詳見表3。隨制劑貯藏時間延長，苦杏仁苷含量逐漸降低，故將制劑的含量限度制定為，每片含苦杏仁以苦杏仁苷計不得少于0.40 mg。

表3 樣品含量測定結果（mg/片）Tab.3 Results of content determination of amygdalin in the samples（mg/tablet）

3 討論

苦杏仁苷含量測定研究的預試驗中，考察了207 nm和210 nm 2 種檢測波長，結果表明，檢測波長為210 nm時峰形更好，苦杏仁苷峰理論板數更高。對乙腈?0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V，梯度洗脫），甲醇?水（20∶80，V/V），甲醇?水（18∶82，V/V），甲醇?水（15∶85，V/V）4 種流動相進行考察，結果表明，以甲醇?水（15∶85，V/V）為流動相時分離效果較好，故選取檢測波長210 nm，流動相為甲醇?水（15∶85，V/V）。提取溶劑考察了甲醇和70%甲醇，結果表明70%甲醇提取樣品效果更好，故選擇；對提取溶劑量、超聲提取功率和提取時間也進行了考察，結果表明，以25 mL 70%甲醇超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min為宜。

預試驗中對處方中百部藥材進行TLC 鑒別，發現同一鑒別方法不適用于3 種百部藥材，藥典收載的3 種來源的百部所含生物堿種類差異大，且產地多，同品種不同產地所含的生物堿也不同，很難以同一質量標準進行鑒別。建議對3種基源百部的主產區樣品分別建立鑒別方法，以便更好地控制制劑質量。

綜上所述，該含量檢測分析方法準確可靠，操作簡單，重復性好，耐用性高，可作為止咳片中苦杏仁苷的含量測定方法。與止咳片原標準相比，本研究中新增了苦杏仁苷含量測定項目，有助于進一步完善止咳片質量標準，從而為相關國家標準和行業標準的制訂提供依據，以保證其臨床的安全有效使用。