槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物對脂多糖誘導小鼠抑郁樣行為的影響及作用機制研究

鮑斐斐 華 深 陳勇華

文獻報道，全球約有3.5 億抑郁癥患者，且預計到2030 年，抑郁癥患者在全球范圍內已成為人類死亡的第二大疾患，且逐年呈遞增趨勢[1]。該病以悲觀失望、睡眠困難、自卑、記憶減退等為主要臨床癥狀，具有易發病、易致殘、易反復等特點。目前，臨床常采用西藥治療抑郁癥，但西藥具有不良反應，且停藥后，易復發。槲皮素是一種天然的黃酮類物質，具有抗血栓、神經保護、調節免疫等藥理作用[2]。貫葉金絲桃含有金絲桃苷、偽金絲桃素、金絲桃素等，具有抗炎鎮痛、抗抑郁、抗抑郁、調節免疫等藥理作用[3]。本研究探討槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物對脂多糖誘導小鼠抑郁樣行為的影響及相關機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 7 周齡雄性清潔級C57BL/6 小鼠90只，購自重慶醫科大學實驗動物中心，體質量（200±20）g，動物生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003，動物使用許可證號：SCXK（渝）2018-0021，動物質量合格證號：2020134617，飼養于重慶醫科大學實驗動物中心，設置溫度為23～25 ℃，濕度為50%～60%，自由進食及飲水。適應性飼養1 周后，在浙江省立同德醫院動物實驗室進行實驗，由鮑斐斐、華深、李曉一、陳勇華等共同參與實驗，在實驗過程中需嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要藥物 脂多糖（美國sigma 公司，批號L2880）；鹽酸氟西汀分散片（禮來蘇州制藥有限公司，批號7339A，分包裝批號7339AA）；貫葉金絲桃提取物（由我院實驗室自制，每克含貫葉金絲桃素不低于1.61 mg，給藥制劑含貫葉金絲桃提取物不低于55%，批號0180518）。

1.3 儀器及試劑 自主活動實驗視頻分析系統（淮北正華生物儀器設備有限公司，型號ZHZFT）；自動酶標儀（華衛德朗儀器有限公司，型號DR-200Bs）；低溫離心機（德國Eppendorf AG 公司，型號5427R）；超聲細胞粉碎機（新芝生物科技股份有限公司，型號scientz-IID）；槲皮素（美國sigma 公司，批號337951）；白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）酶聯免疫吸附試劑盒（北京方程生物科技有限公司，試劑批號MM-0670R22）；去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（NA）試劑盒（北京誠林生物技術有限公司，批號20170201、20170106）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥 90 只雄性C57BL/6 小鼠采用隨機數字表法分為對照組、模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組和槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組，各15 只。除對照組外，其余各組小鼠均單次注射1 mg/kg 脂多糖，制備抑郁模型[4]。采用曠場實驗（OFT）[5]觀察是否制備成功。OFT：小鼠注射藥物12 h 后，放入測試箱正中格內，適應3 min，采用Anaze Y 軟件記錄小鼠5 min 內穿格次數和運動路程。

槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃，貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃，槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃，鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，連續給予21 d。給藥劑量參考文獻[6]。

2.2 糖水偏好實驗 對小鼠進行禁食禁水20 h。在每個鼠籠里面放置清水和蔗糖水各100 mL，1 h 后取出，再次稱重，記錄剩余重量。糖水偏好值=糖水消耗量/（糖水消化量+清水消化量）×100%。

2.3 水迷宮實驗 采用圓形水池（直徑120 cm），將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ個象限，將平臺放入水中，使平臺低于水面1 cm，目標象限為第Ⅲ象限（平臺所在象限），水溫設置為21 ℃左右，用墨汁將水染成黑色。上述糖水偏好實驗后，將小鼠根據Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ個象限的順序面朝池壁放入水中，對小鼠找到平臺所需時間（潛伏期）和所占目標象限百分比進行記錄。

2.4 小鼠腦組織炎癥細胞因子及單胺類神經遞質水平 上述實驗結束后，將小鼠斷頸取腦，將小腦去除后稱重腦組織，根據腦組織重量與預冷酸性正丁醇溶液按照1∶10 的比例放入電動玻璃勻漿機勻漿。混勻后離心取上漿液，IL-6、IL-10 水平采用酶聯免疫吸附法檢測，NE、NA 采用熒光分光光度計按熒光光度測定法測定。

2.5 統計學方法 應用SPSS 21.0 軟件分析數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數資料以率（%）表示，采用卡方χ2檢驗。以P＜0.05 認為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠糖水偏好比較 對照組及槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組小鼠糖水攝入量明顯高于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05）；槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組、槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組糖水攝入量均高于模型組（P 均＜0.05）；貫葉金絲桃提取物組糖水攝入量明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠糖水偏好比較（）

表1 各組小鼠糖水偏好比較（）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

3.2 各組小鼠水迷宮實驗結果比較 對照組及槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組潛伏期明顯低于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P均＜0.05），所占目標象限時間百分比明顯高于模型組、槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05）；槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組潛伏期明顯低于模型組（P 均＜0.05），所占目標象限時間百分比明顯高于模型組（P 均＜0.05）；貫葉金絲桃提取物組潛伏期明顯低于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），所占目標象限時間百分比明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠水迷宮實驗結果比較（）

表2 各組小鼠水迷宮實驗結果比較（）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

3.3 各組小鼠腦組織炎癥細胞因子水平比較 對照組與槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組腦組織IL-6水平明顯低于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05），IL-10 水平明顯高于模型組、槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05）；槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組IL-6 水平明顯低于模型組（P 均＜0.05），IL-10 水平明顯高于模型組（P 均＜0.05）；貫葉金絲桃提取物組IL-6 水平明顯低于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），IL-10 水平明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組（P 均＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠腦組織炎癥細胞因子水平比較（pg/g，）

表3 各組小鼠腦組織炎癥細胞因子水平比較（pg/g，）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃；IL-6 為白介素-6；IL-10 為白介素-10；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

3.4 各組小鼠腦組織單胺類神經遞質水平比較 對照組及槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組小鼠腦組織DA、NA 水平明顯高于模型組、鹽酸氟西汀組、槲皮素組、貫葉金絲桃提取物組（P 均＜0.05），槲皮素組、鹽酸氟西汀組、貫葉金絲桃提取物組小鼠腦組織DA、NA 水平均高于模型組（P 均＜0.05），貫葉金絲桃提取物組小鼠腦組織DA、NA 水平明顯高于槲皮素組、鹽酸氟西汀組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠腦組織單胺類神經遞質水平比較（ng/g，）

表4 各組小鼠腦組織單胺類神經遞質水平比較（ng/g，）

注：對照組及模型組給予50 mg/kg 生理鹽水灌胃；鹽酸氟西汀組給予2.6 mg/kg 鹽酸氟西汀灌胃；槲皮素組給予50 mg/kg 槲皮素灌胃；貫葉金絲桃提取物組給予50 mg/kg 貫葉金絲桃提取物灌胃；槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物組給予槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物各50 mg/kg 灌胃；NE 為去甲腎上腺素；NA 為多巴胺；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與鹽酸氟西汀組和槲皮素組比較，cP＜0.05；與貫葉金絲桃提取物組比較，dP＜0.05

4 討論

槲皮素又稱櫟精，具有較強的自由基清除能力及抗氧化性，能夠捕獲自由基預防脂質過氧化反應，對腫瘤具有抑制作用，還具有較強的抗過敏、抗炎、抗菌等生物活性[7]。貫葉金絲桃是藤黃科植物貫葉金絲桃L.的干燥地上部分，其功效為消腫、清熱利濕、疏肝解郁。臨床常用于治療心胸郁悶、情志不暢及肝氣郁結等。藥理研究證實，貫葉金絲桃提取物具有顯著的抗抑郁成分，且抗炎鎮痛作用明顯[6]。胡甜等[8]研究結果顯示，槲皮素可有效縮短糖尿病小鼠逃避潛伏期，降低空腹血糖水平。本研究結果提示，槲皮素、貫葉金絲桃提取物及槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物均能夠促使抑郁小鼠糖水偏愛分數明顯升高，縮短尋找平臺潛伏期的時間，增加所占目標象限百分比，其中槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物效果更佳。表明槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物具有更明顯的抗抑郁作用。

IL-6、IL-10 等細胞炎癥因子在抑郁癥中發揮重要的作用。IL-6 可促使星形細胞和小神經膠質細胞激活，誘導其他細胞因子生成，其在抑郁癥患者中呈高表達[9]。IL-10 對促炎性細胞因子具有抑制作用，可抑制炎癥反應的發生，其水平降低會促使抑郁癥的發生，誘導炎癥細胞因子水平上升，致使嚴重抑郁癥的發生[10]。本研究結果顯示，槲皮素、貫葉金絲桃提取物及槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物能夠降低抑郁小鼠炎癥因子水平，其中槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物降低抑郁小鼠炎癥因子水平更明顯。

既研究證實，抑郁癥大鼠會導致海馬組織DA、NA 水平降低，提示抑郁癥與中樞NA 功能下降相關；另外，DA 通絡與情緒反應密切相關，其水平降低與抑郁癥發生、發展密切相關，其水平越低，則抑郁癥狀越明顯[11]。貫葉金絲桃提取物對DA 在攝取具有抑制作用，神經遞質減少對突觸前膜的重吸收，致使神經遞質的合成和釋放增加，從而能夠增加其在突觸間隙的濃度[7]。本研究結果顯示，槲皮素、貫葉金絲桃提取物及槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物能夠升高抑郁小鼠腦組織中單胺類神經遞質水平，具有抗抑郁的作用，其中槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物抗抑郁水平更明顯。

總之，槲皮素聯合貫葉金絲桃提取物能夠促使抑郁小鼠糖水偏愛分數明顯升高，縮短尋找平臺潛伏期的時間，增加所占目標象限百分比，減低炎癥細胞因子水平，增加單胺類神經遞質水平發揮抗抑郁作用。