基于網絡藥理學探討干姜黃芩黃連人參湯改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用機制

彭智平 張琳琳

國際糖尿病聯合會糖尿病地圖集顯示，全球約有4.63 億糖尿病患者，中國糖尿病患者約為1.16億，占全球糖尿病患者總數的1/3[1]，其中糖尿病不同類型中又以2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）為主。胰島素抵抗是T2DM 的主要發病機制之一，而傳統醫學具有多成分、多靶點及多途徑的特點，對改善胰島素抵抗具有較大的優勢[2-3]。干姜黃芩黃連人參湯屬于經典名方，前期研究與文獻報道已明確該方可改善胰島素抵抗[4]，然而其機制未有進一步闡釋。網絡藥理學是采用多種數據庫網絡分析藥物、成分、疾病與靶點之間關系的藥理學分支學科，可以在一定程度上提示藥物對疾病的作用機制，故本研究借助網絡藥理學方法分析干姜黃芩黃連人參湯干預的機理，為該方下一步深入基礎實驗研究和臨床應用提供依據[5-6]。

1 材料與方法

1.1 干姜黃芩黃連人參湯藥物活性成分與靶點篩選借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[7]（traditional Chinese medicine systems pharmacology atabase and analysis platform，TCMSP），根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的2 個ADME [“吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）和外排（excretion）”的簡稱]屬性值進行藥物主要活性成分篩選，以及藥物活性成分作用的蛋白質靶點，并在Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org）規范靶點基因[8]。

1.2 T2DM 基因靶點的篩選 采用常用的OMIM 數據庫（http://www.omim.org）、DrugBank 數據庫（https://www.drugbank.ca）、Genecards 數據庫（https://www.genecards.org）等，其中Genecards 數據庫中分數（Score）越高表示與疾病關系越緊密，T2DM 在該數據中由于靶點較多，故根據目標靶點多次取大于中位數的基因靶點為疾病潛在靶點，然后合并3 個疾病數據庫基因靶點，最后刪除重復基因靶點即為T2DM 對應的基因靶點。

1.3 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 靶點蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網絡構建 根據干姜黃芩黃連人參湯藥物成分基因靶點與T2DM 基因靶點取交集，兩組基因靶點繪制韋恩圖，篩選出重疊基因，利用String11.0 數據庫（https://string-db.org）構建PPI 網絡圖，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”（＞0.4），其余設置均為默認設置，得到PPI 網絡。

1.4 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM PPI 網絡圖中核心靶點的篩選 運用CytoScape3.7.1 軟件構建干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 交集基因靶點網絡圖，利用CytoScape3.7.1 內置工具分析交集靶點的網絡拓撲參數，根據節點之間屬性值，包括連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（combined score）等，并根據網絡拓撲學參數節點大小、顏色及粗細判斷核心靶點。

1.5 生物信息分析 應用Metascape 平臺（http://metascape.org/gp/index.html）的數據資料[9]，將干姜黃芩黃連人參湯治療T2DM 的靶點錄入Metascape 平臺，物種設置為H.sapiens，然后進行個性分析，P＜0.01，從而得到其生物學過程與通路富集分析。

2 結果

2.1 干姜黃芩黃連人參湯活性成分靶點的獲取 分析得到干姜黃芩黃連人參湯方中主要含有81 個活性成分（干姜5 個，黃連14 個，黃芩36 個，西洋參11個，知母15 個），其中重復值采用統一代號命名，共得到60 種候選化合物。干姜含有姜辣素等，對應的基因靶點有PIK3CG、KCNH2、DRD1、CHRM3、CHRM1、SCN5A、GABRA2、CHRM4、PDE3A、HTR2A等；黃芩的主要成分含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等，對應的基因靶點有NOS2、PTGS1、AR、PTGS2、DPP4、PRSS1、NCOA2、PIK3CG、CHEK1、ADRB2、PDE3A、RELA、BCL2、CDKN1A 等100 多種；黃連的主要成分含有黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀等，對應的基因靶點有PIK3CG、NCOA2、DPP4ERBB2、PPARG、ACACA、HMOX1、CYP3A4、CYP1A2 等100多種；西洋參含有人參皂苷Rg、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 等，對應的基因靶點有PTGS2、PGR、NR3C2、NCOA2、PTGS1、PTGS2、PIK3CG、KCNH2 等；知母含有芒果苷、知母皂苷B 等，對應的基因靶點有CHRM1、ADRB1、SCN5A、HTR2A、ADRA1A、CHRM2、ADRA1B、GABRA1 等。該方的藥物成分-靶點網絡圖，見圖1。

圖1 藥物、成分與基因靶點圖

2.2 T2DM 基因靶點的獲取 根據T2DM 基因靶點數據庫的篩選，從OMIM 數據庫獲取508 個基因靶點，DrugBank 數據庫獲取101 個基因靶點，Genecards 數據庫獲取1537 個基因靶點。由于Genecards 數據庫中原始靶點基因較多，根據篩選靶點基因目標，設定Score 大于中位數的目標靶點為T2DM 的潛在靶點，并且按照此方法進行多次篩選，共篩選出1537 個基因靶點為T2DM 的潛在靶點。把OMIM、DRUGBANK、Genecards 數據庫合并后刪除重復值，最終得到2062 個T2DM 的基因靶點。

2.3 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 靶點PPI 網絡的構建 通過篩選干姜黃芩黃連人參湯藥物活性成分靶點與T2DM 疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖，得到干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 共同靶點148 個（見圖2），具體如下：XDH、VEGFA、VCAM1、TP53、TNF、THBD、TGFB1、STAT1、SPP1、SOD1 等。進而將靶點提交至STRING11.0 平臺，得到干姜黃芩黃連人參湯靶點PPI 網絡（見圖3）。

圖2 成分靶點圖與疾病靶點圖

圖3 蛋白互作網絡圖

2.4 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 網絡圖中核心靶點的獲取 運用CytoScape3.7.1 軟件構建干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM-交集基因靶點-通路網絡，利用String11.0 數據庫獲取string_interactions.tsv 插件，然后把該插件導入CytoScape3.7.1 軟件（見圖4）。通過CytoScape3.7.1 內置的NetworkAnalyzer分析干姜黃芩黃連人參湯治療T2DM 網絡拓撲學參數，得到核心作用靶點：TNF、IL-6、TP53、CASP3、IL-10、MAPK1、AKT1、VEGFA、MMP9、EGFR1、MYC、PTGS2、MAPK8、EGF、IL-1β 等。

圖4 蛋白互作網絡互作圖

發現在該關鍵靶點信息中免疫炎癥基因靶點較多，故而進一步提取了這些節點相互作用關系進行分析，得到了PPI 網絡結構圖中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF等基因靶點PPI 網絡互作圖中相互作用（見圖5）。

圖5 蛋白互作網絡互作圖關鍵節點之一

2.5 交集基因靶點基因本體（gene ontology，GO）生物功能與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 應用Metascape 數據平臺對干姜黃芩黃連人參湯治療T2DM 相關靶點進行信號通路分析，得出干姜黃芩黃連人參湯主要參與的生物學過程與富集通路包括AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、JAK-STAT 信號通路（Jak-STAT signaling pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）等多種信號通路干預T2DM。

3 討論

干姜黃芩黃連人參湯出自《傷寒論·厥陰病篇》，原方由黃芩、黃連、人參、干姜四味藥組成，后經筆者導師仝小林教授化裁以西洋參易人參，并加入知母，在臨床干預T2DM 中具有較好療效。從方中藥物分析可知，黃芩、黃連苦寒清胃熱，佐以干姜辛溫散寒以防芩連過于苦寒傷胃，藥物寒熱配伍使胃熱得清而不傷胃，辛開苦降合用而有利于中焦脾胃升清降濁、斡旋氣機，西洋參甘溫扶脾補益中氣，全方共奏清胃熱健脾益氣之功，符合“消癉”的脾虛胃熱型病機特點[10-12]。而T2DM 屬中醫中醫“消癉”范疇，仝小林院士提出糖尿病的自然發展進程其中之一即為“消癉”—消渴—消渴并發癥，其中“消癉”的病位在脾胃，核心病機為脾虛胃熱，治宜清胃健脾，該治則符合干姜黃芩黃連人參湯的核心病機[13]。且前期研究也已表明，干姜黃芩黃連人參湯可改善胰島素抵抗，為進一步探索該方的作用機制，本實驗研究借助網絡藥理學技術，剖析了干姜黃芩黃連人參湯改善胰島素抵抗的關鍵作用靶點與可能作用機制。

本實驗研究通過網絡藥理學方法篩選出干姜黃芩黃連人參湯60 種活性成分，包含有黃芩苷、黃芩素、黃連堿、藥根堿、人參皂苷、芒果苷、知母皂苷、姜辣素等，得到220 個基因靶點，構建了藥物-成分-靶點網絡圖，結果表明一個藥物的一個成分可同時作用于多個基因靶點，同時多個藥物的多個成分也可以作用于同一個基因靶點，故提示干姜黃芩黃連人參湯是通過多成分多靶點多途徑起到干預治療作用。

本實驗下一步獲取了T2DM 的基因靶點，按照獲取基因靶點目標篩選，最終得到2062 個基因靶點。然后與干姜黃芩黃連人參湯藥物活性成分靶點取交集，共得到共同靶點148 個，最后通過對交集基因進行PPI 蛋白互作網絡分析，而且通過CytoScape3.7.1 軟件分析得到核心作用基因靶點：TNF、IL-6、TP53、CASP3、IL-10、MAPK1、AKT1、VEGFA、MMP9、EGFR1、MYC、PTGS2、MAPK8、EGF、IL-1β等，在核心基因靶點中發現以IL-6、IL-10、IL-1β、TNF等調節免疫炎癥基因靶點在PPI 網絡互作圖中相互作用明顯，這也就提示干姜黃芩黃連人參湯可能是通過免疫炎癥途徑干預T2DM 的作用機制。

通過GO 生物功能與KEGG 通路富集分析，發現干姜黃芩黃連人參湯可通過AGE-RAGE 信號通路、NF-κB 信號通路、鈣信號通路、JAK-STAT 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路等多種信號通路干預T2DM，初步揭示了該方具有調控多種信號通路改善T2DM 胰島素抵抗的作用。

總之，本實驗研究初步表明，干姜黃芩黃連人參湯具有改善T2DM 的作用，體現了該方多成分、多靶點及多途徑的作用特點，且可能通過免疫炎癥途徑改善T2DM 的重要作用途徑，下一步擬通過動物實驗應用酶聯免疫吸附法、流式細胞術與蛋白組學技術Western blot 法等檢測技術進一步明確干姜黃芩黃連人參湯干預T2DM 的生物學機制。