細胞外囊泡裝載多柔比星對人膀胱癌BIU-87 細胞增殖及凋亡的影響*

馬燕凌，晏 菲，魏武杰，鄧 潔，李 黎，劉 莉，孫建海

（江漢大學附屬湖北省第三人民醫院腫瘤科，湖北 武漢 430000）

膀胱癌（BC）是泌尿生殖系統常見惡性腫瘤，超70%的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）［1］。臨床治療NMIBC 常先行經尿道膀胱腫瘤切除術，然后以多柔比星行膀胱內化學藥物治療（簡稱化療）。然而，隨著NMIBC 分期和分級的增長，復發率超過50%［2］。膀胱內化療與靜脈內輸注化療藥物一樣，不能完全消除癌細胞，同時，由于其靶向性差、副作用多等缺點，限制了多柔比星的療效［3］。近年來，細胞外囊泡（EVs）在腫瘤進展和治療中的作用引起了廣泛關注［4］。細胞能釋放不同大小的微囊泡，在受到刺激后，細胞改變其骨架，導致胞質內容物被包裹在細胞膜中，形成囊泡，隨后被釋放到細胞外空間，通過在細胞間轉移生物活性和功能活性蛋白及RNA 來介導細胞間通信［5］。載藥囊泡是腫瘤細胞來源的EVs經過特殊處理，與常規化療藥物有機結合，形成以囊泡為載體的載藥微顆粒，具有靶向性和特異性高及副作用小等特點［6］。同時，β ?連環蛋白（β ?catenin）/ Notch1 通路與膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌的轉移相關，對細胞的分化、增殖和凋亡有顯著影響［7］。因此，本研究中探討了EVs 裝載多柔比星對人膀胱癌BIU ?87 細胞增殖和凋亡的影響，及β ?catenin/Notch1 通路在其中的作用，為膀胱癌的臨床治療提供新的理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：240i型CO2培養箱（美國Thermo Revco公司）；Z36HK 型高速冷凍離心機（德國Hermle 公司）；TE2000 ?U + DXM1200 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；BS ?1096B 型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；Real ?time PCR 擴增儀（美國ABI 公司）；BD FACSCanto 型流式細胞儀和BD 垂直電泳儀（美國BD 公司）；Tanon 1600型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）。

試藥：多柔比星（齊魯制藥有限公司，批號為2020064）；RPMI ?1640 培養基、胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；PKH67試劑盒（美國Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Amresco 公司）；膜聯蛋白（Annexin）V/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；cDNA反轉錄試劑盒和實時熒光聚合酶鏈式反應（RT ?PCR）試劑盒（瑞士Roche 公司）；RIPA 裂解液和Western blot 相關試劑（北京索萊寶生物技術公司）；糖原合成酶激酶?3β（GSK ?3β）、β ?catenin、Notch1、β ?actin抗體和HRP標記山羊抗鼠IgG二抗（上海碧云天生物技術有限公司）。

細胞：人膀胱癌BIU ?87 細胞（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和EVs 提取

在37 ℃、5% CO2條件下用含10% FBS 的RPMI ?1640 培養基培養BIU ?87 細胞，隔天換液，當細胞處于對數生長期時進行后續試驗。將60 mL 含2% FBS 的培養基離心（30 900 r/min）過夜，去除血清中的EVs，用此培養基培養BIU ?87細胞（約5×107個），48 h內收集上清，1 200 r/ min 離心10 min，經0.45 μm 過濾器過濾；4 000 r / min 離心30 min，經0.22 μm 過濾器過濾；30 900 r/ min 離心70 min，將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液（PBS），即得EVs混懸液。

1.2.2 載藥囊泡制備

取多柔比星30 μg，溶于1 mL EVs 混懸液中，在37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h，9 168 r/ min 離心10 min，經0.22 μm 過濾器過濾；30 900 r/ min 離心70 min，將沉淀溶于PBS，即得載藥囊泡混懸液。

1.2.3 觀察指標與檢測

細胞攝取EVs情況：向EVs混懸液和載藥囊泡混懸液中分別加入4 μL PKH67稀釋液，混勻，靜置3 min，用PBS終止染色，經0.22 μm過濾器過濾；30 900 r/min離心70 min，將沉淀溶于PBS，即得PKH67 標記的EVs 和PKH67 標記的載藥囊泡。取對數生長期BIU ?87 細胞，以5 × 103個/ 孔接種于96 孔板中（每孔200 μL），待細胞融合后分別加入PKH67標記的EVs和PKH67標記的載藥囊泡，靜置24 h，顯微鏡下觀察細胞攝取情況。

細胞增殖率：采用MTT 法。實驗分為空白對照組（不進行處理）、EVs 組（EVs 混懸液，100 個/ 細胞）、多柔比星組（0.3 μg 多柔比星）、載藥囊泡組（載藥囊泡混懸液，100個/細胞），以相應方法處理細胞，44 h后加入MTT（每孔50 μL），繼續培養4 h，加入二甲基亞砜（每孔200 μL），緩慢振蕩10 min，用酶標儀在490 nm 波長處檢測各孔吸光度（OD）值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=OD實驗組/OD空白對照組。

細胞凋亡率：采用流式細胞法。按“細胞增殖率”項下分組及處理細胞，48 h后收獲細胞，用預冷PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，棄上清，分別加入5 μL Annexin V ?FITC 與PI，充分混勻后室溫避光孵育20 min，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

細胞中GSK ?3β，β ?catenin 和Notch1 mRNA 表達：采用RT ?PCR法。按“細胞增殖率”項下分組及處理細胞，48 h 后收獲細胞，加入Trizol 提取總RNA，反轉錄制備cDNA。反應條件為，95 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環；72 ℃延伸7 min。讀取循環閾值（Ct值），以2-ΔΔCt表示GSK ?3β，β ?catenin 和Notch1 mRNA 的表達量（以β ?actin 為內參）。

細胞中GSK ?3β，β ?catenin 和Notch1 蛋白表達：采用Western blot 法。按“細胞增殖率”項下分組及處理細胞，48 h 后收獲細胞，各組分別加入100 μL RIPA 裂解液，進行電泳（每孔20 μg），轉膜，加入GSK ?3β（1∶200）、β ?catenin（1∶400）和Notch1（1∶400）抗體孵育（4 ℃過夜）；用HRP 標記山羊抗鼠IgG 二抗（1∶5 000）在室溫下孵育30 min，顯色、采集圖像并分析（以β ?actin 為內參）。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行單因素方差分析，多重比較采用SNK ?q檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

A.空白對照組 B.EVs組 C.多柔比星組 D.載藥囊泡組圖2 載藥囊泡對BIU-87細胞增殖的影響A.Blank control group B.EVs group C.Doxorubicin group D.Drug ?loaded vesicle groupFig.2 Effect of drug-loaded vesicles on the proliferation of BIU-87 cells

2 結果

2.1 BIU-87 細胞攝取EVs 情況

EVs 組和載藥囊泡組BIU ?87 細胞內PKH67 標記的團塊狀綠色熒光均勻，提示BIU ?87細胞可攝取EVs和載藥囊泡。詳見圖1。

圖1 BIU-87細胞攝取EVs和載藥囊泡情況Fig.1 The uptake of EVs and drug - loaded vesicles by BIU-87 cells

2.2 細胞增殖率及凋亡率

與空白對照組比較，EVs組細胞增殖率及細胞凋亡率無顯著差異（P＞0.05）；與空白對照組及EVs 組比較，多柔比星組和載藥囊泡組細胞增殖率顯著降低、細胞凋亡率顯著升高，且載藥囊泡組更優（P＜0.05）。詳見圖2和表1。

表1 各組細胞增殖率和凋亡率比較（±s，%，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of BIU-87 cells in each group（±s，%，n=3）

表1 各組細胞增殖率和凋亡率比較（±s，%，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation rate and apoptosis rate of BIU-87 cells in each group（±s，%，n=3）

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與EVs組比較，bP ＜0.05；與多柔比星組比較，cP ＜0.05。表2及表3同。Note：Compared with those in the blank control group，aP ＜0.05；Compared with those in the EVs group，bP ＜ 0.05；Compared with those in the doxorubicin group，cP ＜0.05（for Tab.1 ?3）.

組別空白對照組EVs組多柔比星組載藥囊泡組細胞增殖率100.00±9.42 97.58±14.36 76.10±6.82ab 57.42±7.69abc細胞凋亡率1.84±0.27 2.29±0.49 5.78±0.82ab 9.30±0.75abc

2.3 GSK-3β，β-catenin 和Notch1 mRNA 表達水平

與空白對照組比較，EVs 組細胞中GSK ?3β、β ?catenin和Notch1 mRNA表達水平無顯著差異（P＞0.05）；與空白對照組及EVs組比較，多柔比星組和載藥囊泡組細胞中GSK ?3β mRNA 表達水平顯著升高、β ?catenin和Notch1 mRNA 表達水平顯著降低，且載藥囊泡組更優（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組細胞中GSK-3β、β-catenin和Notch1 mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 mRNA expression levels in cells in each group（±s，n=3）

表2 各組細胞中GSK-3β、β-catenin和Notch1 mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 mRNA expression levels in cells in each group（±s，n=3）

組別空白對照組EVs組多柔比星組載藥囊泡組GSK ?3β 1.00±0.15 0.96±0.11 1.32±0.08ab 1.56±0.13abc β ?catenin 1.00±0.07 1.04±0.13 0.87±0.09ab 0.72±0.10abc Notch1 1.00±0.14 0.98±0.07 0.85±0.11ab 0.70±0.10abc

2.4 GSK-3β，β-catenin 和Notch1 蛋白表達水平

與空白對照組比較，EVs 組細胞中GSK ?3β、β ?catenin和Notch1 蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05）；與空白對照組及EVs組比較，多柔比星組和載藥囊泡組細胞中GSK ?3β 蛋白表達水平顯著升高、β ?catenin和Notch1 蛋白表達水平顯著降低，且載藥囊泡組更優（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組細胞中GSK-3β，β-catenin和Notch1蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 protein expression levels in cells in each group（±s，n=3）

表3 各組細胞中GSK-3β，β-catenin和Notch1蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of GSK-3β，β-catenin and Notch1 protein expression levels in cells in each group（±s，n=3）

組別空白對照組EVs組多柔比星組載藥囊泡組GSK ?3β 0.42±0.09 0.45±0.13 0.73±0.06ab 0.89±0.10abc β ?catenin 0.38±0.05 0.38±0.06 0.25±0.04ab 0.13±0.03abc Notch1 0.49±0.06 0.46±0.07 0.30±0.05ab 0.08±0.03abc

3 討論

NMIBC 具有易侵犯、易轉移、易耐藥和復發率高等特點，故急需新療法來增強NMIBC 對膀胱內化療的敏感性。EVs 是細胞釋放的囊泡狀結構，可被癌細胞有效吸收，使EVs 裝載化療藥物作用于癌細胞成為可能［8］。研究表明，載藥囊泡是以癌細胞來源的EVs作為化療藥物載體，攜帶化療藥物，可將藥物輸入癌細胞內，具有極強的癌細胞親和力及較好的靶向性［9］。多柔比星是NMIBC 術后膀胱內化療的首選藥物，通過抑制DNA 拓撲異構酶Ⅱ活性，誘導癌細胞凋亡，但其在體內缺乏特異性且清除過快，降低了化療有效性［10］。本研究中通過EVs 裝載多柔比星給藥，升高了BIU ?87 細胞凋亡率，降低了其增殖率，提示載藥囊泡可作為理想的敏化劑，增強化療藥物對膀胱癌細胞的殺傷力。同時，膀胱上皮屬移行上皮，其結構中有一層圓頂狀細胞的淺層，這一結構細胞排列在管腔表面，作為管腔和血流間不可穿透的屏障，可抑制載藥囊泡進入更深的細胞層。然而，這種物理屏障可能由于其不規則的組織結構而在膀胱癌組織中被破壞，使載藥囊泡進入膀胱癌細胞［11］。本研究中主要關注了載藥囊泡對BIU ?87細胞的作用，其對正常膀胱細胞的作用將在后續的研究中完善。

β ?catenin/ Notch1 通路參與哺乳動物胚胎發育、器官發生、細胞凋亡及各種癌細胞遷移的調節［12］。與β ?catenin/Notch1 通路中的正向調節因子β ?catenin不同，GSK ?3β 屬負調控因子，GSK ?3β 磷酸化β ?catenin 的氨基端絲氨酸/蘇氨酸，從而下調β ?catenin在細胞質中的表達，阻斷β ?catenin/Notch1 通路的激活，減弱β ?catenin/Notch1通路對凋亡的抑制，促進細胞凋亡［13］。作為β ?catenin/Notch1 通路的下游信號因子，Notch1已被證明是BC的腫瘤促進因子，Notch1過表達促進了上皮間質轉化的進程［14］。在鼻咽癌中，抑制Notch ?1 可增加Kruppel 樣因子4（KLF4）的表達，從而減少鼻咽癌細胞增殖和抑制腫瘤形成［15］。同時，轉染Notch1 siRNA 的細胞增殖率明顯低于轉染Notch1 的細胞［16］。由于增殖與化療抗性有關，開發針對抗增殖的調節劑，可獲得新的化療增敏劑［17?18］。本研究結果顯示，載藥囊泡抑制β ?catenin/Notch1通路的作用明顯強于單用多柔比星。因此，β ?catenin/Notch1通路下調可能為抑制BC 細胞增殖提供了一個靶點，具有潛在的臨床意義。

綜上所述，EVs 裝載多柔比星抑制BIU ?87 細胞增殖和促進其凋亡的作用較單用多柔比星強，其機制可能與抑制β ?catenin/Notch1信號通路有關。