小細胞肺癌轉移相關miRNAs 的生物信息學分析

劉蓉，劉敏

(1.石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000；2.新疆軍區總醫院，新疆 烏魯木齊 830000)

0 引言

肺癌是發病率最高的惡性腫瘤之一，小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC) 占 肺 癌 的15%，生長迅速，惡性程度高預后差，早期即可出現廣泛的遠處轉移，患者的5 年生存率不足10%[1-2]。廣泛期轉移是SCLC 患者預后差的主要原因，而研究顯示60%-80%的患者在確診時即為廣泛期[3]。miRNAs 是長約18-25 個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，與靶基因的3'-非編碼區(untranslation regions，UTR)結合調控基因表達[4]。有研究發現，異常表達的miRNAs 與肺癌腫瘤細胞的黏附、浸潤和轉移密切相關[5-6]。同時，miRNAs 在腫瘤組織及血清中較穩定，使其在早期SCLC 診斷、治療及預后判斷中具有較高的探索價值[7]。

基因芯片是一種快速有效的檢測miRNAs 表達譜的技術，本研究利用基因芯片數據分析軟件Qlucore Omics Explorer 3.0 對來自GEO 數據庫的SCLC 轉移相關的基因芯片數據進行分析：篩選差異表達miRNAs，并運用生物信息學技術初步分析差異性miRNAs 調控SCLC 轉移相關的信號通路、下游靶基因及蛋白，以從整體上了解SCLC 轉移過程中整個基因組及信號通路的變化，為早期診斷、治療SCLC 尋找到相關生物標志物提供生物信息學參考，從而為腫瘤防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 基因表達數據

在GEO Datasets 數據庫檢索框中輸入“small cell lung cancer AND metastasis”，獲 得 由Zhou R等提交的芯片數據。實驗設計采用廣泛期小細胞肺癌(Extensive Disease-SCLC，ED)患者和局限期小細胞肺癌(Limited Disease-SCLC，LD)患者各3例的血清樣本。

1.2 差異miRNAs 的篩選及靶基因預測

先將GEO Datasets 數據庫中獲取的數據輸入至Qlucore Omics Explorer 3.0 在線分析軟件，再對數據進行分析。采用兩組樣本t 檢驗，通過對數據的過濾，篩選出差異表達的miRNAs。利用TargetScan 7.1，miRDB，miRWalk 數據庫對差異miRNAs 進行的靶基因預測，并取交集。

1.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析

利用DAVID 數據庫(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home. jsp)進行GO(Gene Ontology)功能分析及KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，P＜0.05 差異具有統計學意義。

1.4 STRING 蛋白互作分析

聯合使用STRING11.0(https：//stringdb.org/)和Cytoscape 3.6.1 在線分析工具進行靶基因編碼蛋白的互作分析。

2 結果

2.1 ED-SCLC 和LD-SCLC 患者血清中差異表達的miRNAs

以|Fold change| ≥2 和P＜0.05 作 為 選 擇 標準，對差異表達的miRNAs 進行篩選。ED-SCLC組與LD-SCLC 組比較，共篩選出了21 個差異miRNAs(圖1)。并預測出836 個靶基因。

圖1 差異表達miRNAs 聚類分析 紅色:上調基因; 綠色:下調基因

2.2 GO 富集分析

GO 富集分析發現，靶基因共參與多種生物過程。如上調RNA 聚合酶Ⅱ啟動子、轉錄因子結合與激活、細胞連接、DNA 模板的轉錄及結合、上調轉錄以及細胞內受體信號通路等生物學過程(圖2)。

圖2 GO 富集分析

2.3 KEGG 通路富集分析

KEGG 通路分析可用于評估差異表達的信號通路，包括腫瘤通路、Ras、Rap1、PI3K-Akt 信號通路以及調節多能干細胞等信號通路。

2.4 靶蛋白間的相互作用

利用STRING11.0 和Cytoscape 3.6.1 在線分析軟件構建蛋白互作網絡(圖3)。通過差異miRNA靶基因編碼蛋白相互作用網絡的構建，最終得到STAT3、SMAD3、MAPK9、E2F1、MMP2、AKT2 為網絡的中心蛋白。

圖3 靶蛋白互作圖

3 討論

惡性腫瘤早期準確的診斷是醫學所關注的熱點。SCLC 是一種具有高度侵襲性，早期即可經血液、淋巴結發生多器官轉移的惡性腫瘤，其容易發生轉移的確切機制目前仍不清楚。研究發現，miRNAs 可調節腫瘤細胞的增殖、侵襲能力和遷移等[8]。并且與肺癌的發生、發展、遷移及預后密切相關[9]。因此，作為轉移能力強的SCLC，深入研究SCLC 轉移相關的miRNAs，并探討其在SCLC 侵襲遷移中的分子機制，對于為SCLC 早期診療提供新的線索具有重要意義。

本研究通過對芯片數據的分析，共篩選出21個下調差異miRNAs。研究表明，McCubrey 等[10]研究發現Ras 通路參與多種腫瘤的發展與遷移，并發生了Ras 突變。Ras 相關蛋白1(Rap1) 是RAS家族中的一員，可通過PI3K/Akt 等多種信號通路，促進腫瘤細胞增殖、內皮細胞遷移，免疫逃逸等癌變過程[11]。PI3K/Akt 通路在參與細胞生長、分化和應激中扮演重要角色，誘導腫瘤細胞的侵襲和遷移能力增強[12]。PI3K/Akt 通路的激活可促進小細胞肺癌干細胞惡性增殖和定向分化[13]。

研究表明，STAT3 的激活、增強了SMAD3 的表達，增加了肺腫瘤細胞侵襲和轉移[14]。MAPKs在惡性腫瘤的發展中起重要作用，可調節細胞增殖 和 凋 亡[15]。FGFR 能 激 活STAT3、PI3K/Akt 和MAPK 級聯反應，其生物過程涉及細胞的增殖、分化和轉移。其基因突變、過表達等異常信號轉導與一些腫瘤發展及轉移密切相關[16]。在SCLC 中E2F1 升高并參與了腫瘤細胞粘附、侵襲及擴散，同時激活SP1 和NF-κ B[17-18]。從而調控MMPs 的表達促進腫瘤細胞的侵襲遷移功能[19]。Akt2 的活性受PI3K 調控，在多種腫瘤細胞中處于活躍狀態，在腫瘤的惡性增殖、侵襲、耐藥以及免疫逃逸方面發揮重要功能[20]。

本研究利用SCLC 轉移相關基因芯片數據的挖掘，篩選出21 個差異表達miRNAs，差異基因預測結果發現：Ras、PI3K/Akt 通路以及STAT3、SMAD3、MAPK9、E2F1、MMP2 和AKT2 基因可能在SCLC 轉移中發揮著關鍵作用。上述結論為闡明SCLC 轉移發生的分子機制提供了理論支持，為SCLC 的診斷及治療提供了新思路。