25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位點多態性與深圳地區妊娠期糖尿病易感性分析

楊秋娥，潘婷，梁紅梅，羅裕旋，凌晟榮，鐘文英

（深圳市龍華區婦幼保健院，廣東 深圳 518109）

0 引言

妊 娠 期 糖 尿 病（gestational diabetesmellitus，GDM）是指孕前糖代謝正常婦女于妊娠期間發生或首次出現糖尿病或不同程度糖耐量異常或空腹血糖升高，其病因及發病機制目前尚未完全明確，有研究表明，GDM是由環境、遺傳及生活方式等多種因素共同所致的一種復雜性疾病[1-3]。維生素D（Vitamin D，VitD）主要調節鈣、磷代謝，此外還參與糖脂代謝、胰島素合成和分泌、炎性、免疫及腫瘤的發生和發展過程，與多種疾病的發生有密切關系[4-6]。VitD受體（vitamin D receptor，VDR）含有25-（OH）D-1α羥化酶，可使VitD轉化為具有活性的25-(OH)VitD3，且VDR基因多個位點易發生多態性突變，進而影響VitD的水平或結構，從而參與多種疾病發生[7-8]。本文對深圳區域GDM和妊娠期非糖尿病患者血清25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位點多態性進行對比研究分析，了解25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位點多態性與深圳地區GDM的易感性，現報導如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2021年01月至2021年06月深圳市龍華區婦幼保健院婦產科門診及住院部確診GDM患者76例為GDM組。GDM診斷符合《中國2型糖尿病指南（2020年）》[9]中的診斷標準：24～28周口服75 g葡萄糖行OGTT試驗，空腹血糖≥5.1 mmol/L，服糖后1 h血糖≥10.0 mmol/L，2 h≥8.5 mmol/L，其中有一個值達到標準即可診斷GDM。選擇同期在我院婦產科門診及住院部就診的妊娠期非糖尿病患者80例為對照組。納入標準：①單胎妊娠；②無肝、腎、心及產科其它并發癥；③患者及家屬簽署知情同意書；④經醫院倫理委員會批準同意。排除標準：①顯性糖尿病（妊娠期）；②孕前糖尿病；③合并慢肺阻、哮喘、慢性消化性和泌尿系統疾病；④伴有惡性腫瘤者；⑤有糖尿病家屬史者；⑥服用VitD及其他鈣制劑者；⑦伴有甲狀腺疾病者。確保兩組孕婦年齡、孕中期BMI及分娩孕周比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

iflash3000-C化學發光分析儀（深圳亞輝龍）；DNA 提取試劑盒（深圳亞能）；ABI7500儀（美國ABI公司）；基因SNP多態性分析試劑盒（上海吉凱）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

均于清晨抽取空腹外周靜脈血5.0~6.0mL，其中2.0~3.0mL于干燥管內，離心(3500r/min)10min，取血清測定25-(OH)VitD3水平。余下的于EDTA-K2抗凝管內，用于VDR基因rs731236T/C位點多態性分析。

1.3.2 25-(OH)VitD3水平測定

采用化學發光免疫法檢測血清25-(OH)VitD3水平，按試劑和儀器說明書進行操作。

1.3.3 VDR基因rs731236

T/C位點SNP分析 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）法對VDR基因rs731236 T/C位點SNP進行分析。具體方法：（1）DNA提 取；（2）引物設計上游引物：5’-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3’，下游引物：5’-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTC TC-3’；（3）PCR反應體系：反應總體積25.0μL，含模板DNA 2 ng，引物10 nmol，聚合酶1 U，dNTPs5 nmol；（4）擴增條件：95℃預變性10 min，然后以95℃30 s，65℃30 s，72℃延伸60 s，循環35次，最后72℃延伸7min；（5）酶切：取擴增產物4μL，加5 U Apa I酶，10xBuffer TangoTM 2μL，加ddH2O至20ul，37℃水浴消化1 h；（6）多態性分析：取酶切產物于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗比較；計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗比較；遺傳平衡采用Hardy-Weinberg檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組25-(OH)VitD3水平比較

GDM患者血清25-(OH)VitD3水平為（24.93±7.61）mmol/L，明顯低于對照組的（50.27±14.38）mmol/L，兩者差異有統計學意義（t=5.0645，P<0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg檢驗

GDM組和對照組VDR基因rs731236 T/C位點SNP均檢出TT，TC和CC 3種基因型。經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，差異無統計學意義（χ2=1.2048，P>0.05），表明抽樣具有代表性。

2.3 兩組VDR基因rs731236

T/C位點SNP比較 GDM患者VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型及C等位基因檢出率分別為48.68%和59.21%，明顯高于對照組的21.25%和33.13%，差異有統計學意義（χ2=5.8172，4.0721，P<0.05），結果見表1。

表1 GDM組和對照組VDR基因rs731236 T/C位點SNP比較[n（%）]

2.4 不同基因型GDM患者25-(OH)VitD3水平比較

VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型GDM患 者 血 清25-(OH)VitD3水 平 為（13.29±4.58）mmol/L，明顯低于TC和TT基因型的（33.70±6.85）mmol/L和（37.55±8.27）mmol/L，差異有統計學意義（t=6.9125，7.2854，P<0.05），但TC和TT基 因型GDM患者25-(OH)VitD3水平差異無統計學意義（t=1.3028，P>0.05）。

3 討論

GDM是妊娠期間首次發生的糖耐量異常綜合征，可導致多種妊娠不良結局。此外，其還增加產婦及新生兒日后患2型糖尿病（T2DM）和心血管疾病風險，并能引起一系列并發癥及后遺癥，嚴重影響產婦及新生兒生活質量，對母嬰健康造成巨大威脅，且隨著我國經濟和生活水平不斷提高、肥胖率及高齡產婦比例不斷增加，其發病率呈逐年上升趨勢[10-12]。但GDM病因及發病機制目前尚未完全明確，給GDM患者早發現、早診斷及預防帶來很大困難。因此，探索GDM病因及發病機制，對預防、診斷及治療GDM具有重要的臨床意義。

VitD主要調節鈣磷代謝，但最近研究表明，妊娠期孕婦體內VitD缺乏或不足與一系列不良妊娠結局有密切關系[13-14]。而25-(OH)VitD3是VitD主要存在形式，其水平可直接反映人體內VitD儲存水平，且與VitD缺乏的臨床癥狀相關，同時不同地區和種族人群之間存在差異很大[15-17]。本研究結果顯示，深圳地區GDM患者血清25-(OH)VitD3水平較妊娠期非糖尿病孕婦明顯降低（P<0.05），與有關報導基本一致[15-17]，這表明25-(OH)VitD3水平降低可能是導致GDM的發病的危險因素之一。

研究表明，GDM可能由多種因素共同所致的，其中遺傳在其發病中發揮著重要的作用，但有關遺傳病因和發病機制尚未完全清楚。隨著全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）不斷深入研究發現，GDM發生和發展與人體內多個基因多個位點多態性突變有關[18-19]，其中VDR基因多個位點（如是TaqⅠ、FokⅠ、BsmⅠ和ApaⅠ）的多態性突變與GDM發病有關，如張琰等[20]報導遼沈地區漢族女性人群中VDR基因ApaⅠ位點多態性與妊娠期糖尿病存在相關性，但不同地區和種族人群因遺傳背景、環境、免疫及生活習慣等諸多因素的不同而基因多態性存在地域性和種族性差異。本研究結果顯示，深圳地區GDM患者VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型和C等位基因頻率明顯比妊娠期非糖尿病孕婦升高（P<0.05），這表明VDR基因rs731236 T/C位點多態性可能與GDM的發病有密切關系，其中CC基因型可能是本地區GDM發病的危險易感基因之一。此外，攜帶VDR基因rs731236 T/C位點CC基因型的GDM患者血清25-(OH)VitD3水平明顯比妊娠期非糖尿病患者降低（P<0.05），這說明VDR基因rs731236 T/C位點多態性可能通過影響25-(OH)VitD3水平或結構而在GDM發病中發揮作用的。

綜上所述，深圳區域GDM患者25-(OH)VitD3含量顯著降低，其中CC基因型GDM患者降低尤為明顯，且VDR基因rs731236 T/C位點呈多態性分布。因此，加強孕婦25-(OH)VitD3水平及VDR基因rs731236 T/C位點多態性分析，對GDM患者早期診斷、治療及發病機制研究具有重要的意義。