米曲霉協(xié)同抗酸化菌劑制備餐廚垃圾氨基酸液態(tài)肥

賈 璇，李雪琪，劉曉佩，竇潤琦，賈晨浩，高 霞，李鳴曉*

1. 北京工商大學，國家環(huán)境保護食品鏈污染防治重點實驗室，北京 100048

2. 北京工商大學，中國輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點實驗室，北京 100048

3. 中國環(huán)境科學研究院，環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012

隨著我國“無廢城市”管理理念和“垃圾分類”政策的實施，推動生活垃圾源頭減量化、資源化迫在眉睫[1]. 餐廚垃圾是城市生活垃圾的重要組成部分，富含糖類、蛋白質、脂肪等有機物及豐富的微量元素[2]，易腐敗酸化，產(chǎn)生滲濾液、惡臭氣體等二次污染[3]，因此餐廚垃圾就地快速資源化需求迫切.

目前餐廚垃圾資源化方式主要有減量脫水、好氧堆肥和液態(tài)肥制備等. 其中，通過接種功能微生物制備餐廚垃圾液態(tài)有機肥[4-5]，可實現(xiàn)餐廚垃圾高值化利用、土壤改良及碳匯，在改善土壤養(yǎng)分狀況的同時提高作物產(chǎn)量[6-8]. 任連海等[9]采用餐廚垃圾濕熱處理脫出液，通過接種巨大芽孢桿菌，制備解磷液態(tài)菌肥，活菌數(shù)遠高于農(nóng)用微生物菌劑的標準. 郭新愿等[10]用餐廚垃圾廢水作為發(fā)酵基質生產(chǎn)液態(tài)褐球固氮菌肥，可提高土壤的總氮水平.

餐廚垃圾制備液態(tài)有機肥過程中，易降解有機物水解酸化與大分子物質(蛋白質、淀粉、脂肪等)降解轉化不同步[11]，是限制其高值化的關鍵限速步驟.筆者所在團隊前期自主篩選了具有抗酸化功能的復合菌劑，發(fā)現(xiàn)該抗酸化復合菌劑可以有效抑制堆肥前期易降解有機物的快速礦化和小分子酸形成，在限制礦化的同時可實現(xiàn)好氧發(fā)酵體系的酸度調節(jié)[12-13].

米曲霉(Aspergillus oryzae)是目前真菌發(fā)酵產(chǎn)酶最重要的菌株之一，能通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生大量蛋白酶和淀粉酶，米曲霉的高蛋白質、淀粉分解能力可有效降解轉化餐廚垃圾中的大分子物質[14-15]. Pleissner等[16]通過添加泡盛曲霉和米曲霉，研究餐廚垃圾中大分子物質的轉化，結果表明，處理48 h后餐廚垃圾中大分子物質被降解為葡萄糖、游離氨基氮和磷酸鹽，淀粉轉化率為80%～90%. 張帥等[17]接種米曲霉孢子懸浮液至餐廚垃圾培養(yǎng)基中，產(chǎn)物的淀粉酶活性最高可達438.4 U/g. 汪剛慧等[18]發(fā)現(xiàn)，未接種米曲霉的餐廚垃圾只有極低的蛋白酶和淀粉酶活性，而經(jīng)過米曲霉發(fā)酵后餐廚垃圾中的蛋白酶和淀粉酶活性顯著上升，分別提升了73.37和24.52倍.

該研究將自主篩選的抗酸化復合菌劑和米曲霉聯(lián)用，旨在實現(xiàn)餐廚垃圾全量化過程中易降解有機質與大分子物質的同步轉化，制備富含氨基酸的液態(tài)有機肥. 通過不同溫度、初始pH、菌劑接種量的研究，結合高通量測序，闡明蛋白質、淀粉等物質的轉化規(guī)律，探究抗酸化復合菌劑和米曲霉協(xié)同降解餐廚垃圾的工藝條件，以期為實現(xiàn)餐廚垃圾高值化利用提供技術支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1餐廚垃圾

餐廚垃圾取自北京某大學食堂，分揀出餐廚垃圾中骨頭、塑料袋等雜質，將剩余部分混合打漿，過20目(0.850 mm)篩，置于4 ℃冰箱備用[19]. 餐廚垃圾基本理化指標：含水率為85.8%±2.0%，揮發(fā)性固體(VS)含量為16.54%±0.5%，pH為4.3±0.1，蛋白質含量為(2.23±0.13) g/L(濕基)，淀粉含量為(28.32±1.0)g/(100 g)(濕基).

1.1.2微生物菌劑

抗酸化復合菌劑是筆者所在課題組從餐廚垃圾好氧發(fā)酵酸化階段分離篩選制備的復合菌劑[20]. 試驗所用米曲霉CGMCC 3.442 7購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心.

1.2 試驗設計

1.2.1酶源制備

將平板培養(yǎng)的米曲霉收集至無菌瓶中，稀釋后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫孟♂屍桨逵嫈?shù)法測得米曲霉CGMCC 3.443 7(簡稱“米曲霉C”)的孢子懸浮液濃度為85個/mL. 將1 mL孢子懸浮液接種到50 g餐廚垃圾中，38 ℃下培養(yǎng)48 h，獲得富酶產(chǎn)物.

1.2.2正交試驗

餐廚垃圾采用正交試驗研究不同處理條件對功能菌劑快速降解餐廚垃圾的影響. 選取不同溫度、初始pH、功能菌劑接種量設計三因素三水平正交試驗(見表1). 功能菌劑包括抗酸化復合菌劑和富酶產(chǎn)物兩部分，抗酸化復合菌劑接入量1%、10%、20%(V/V)分別對應富酶產(chǎn)物添加量1%、10%、20%(m/V). 所有試驗組和對照組均在相同條件下設計2組平行試驗.

表1 菌劑液態(tài)發(fā)酵條件試驗設計Table 1 Experimental design of bacteria liquid fermentation conditions

取餐廚垃圾25 g，與去離子水按照質量比1∶1混合均勻后，將初始pH分別調節(jié)至6.0、6.5、7.0，滅菌后分別接種等量的富酶產(chǎn)物和抗酸化復合菌劑，置于不同溫度、120 r/min下培養(yǎng)168 h，每隔24 h取樣測定指標.

1.3 分析指標與方法

粗蛋白濃度根據(jù)GB/T 6432-2018《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》測定；游離氨基酸濃度采用茚三酮比色法[21]測定；淀粉濃度采用酸水解法和蒽酮法[22]測定；溶解性碳水化合物濃度采用蒽酮法[23]測定. 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行相關性分析.

微生物多樣性分析：取0.5 g抗酸化復合菌劑樣品，按照the E.Z.N.A.? soil DNA Kit(Omega Bio-tek，Norcross, GA, 美國)步驟提取總RNA，在-20 ℃下進行保存. 純化后的基因組作為聚合酶鏈式反應(PCR)的模板，選用16S rRNA基因V3～V4區(qū)通過引物〔338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')〕進行PCR反應. PCR反應體系：10×PCR Buffer 4 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 2 μL，正向引物(5 μmol/L) 0.8 μL，反向引物(5 μmol/L) 0.8 μL，模板(總DNA) 10 ng. PCR產(chǎn)物用AxyPrepTMMag PCR Normalizer做歸一化處理.

選取A1B1C1(反應溫度為38 ℃、初始pH=6.5、功能菌劑接種量1%的試驗組記為E組)和A2B2C3(反應溫度為55 ℃、初始pH=6.0、功能菌劑接種量20%的試驗組記為F組)試驗組在0、48、72、144 h的樣品進行高通量測序，分別記為E0、E48、E72、E144和F0、F48、F72、F144.

2 結果與討論

2.1 pH的變化

餐廚垃圾中易降解有機質被快速降解時，易造成小分子酸積累，導致pH下降，而餐廚垃圾發(fā)酵過程中pH的變化對于功能菌劑生長繁殖有重要影響. 如圖1所示，各處理組的pH均高于4.5. 餐廚垃圾處理過程中，除處理組1外，其他組pH整體均呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢. 初始pH為7的處理組7、8、9的pH于24 h時分別降至5.16、5.42、5.17，pH降幅相對較大. 溫度為55 ℃的處理組2、6、7，pH于48 h后均低于5.0，且波動不大，可能是因為高溫不適宜抗酸化復合菌劑生長，小分子有機酸的降解受到抑制.處理組1在發(fā)酵至168 h時pH突升至7.98，可能是因為菌體自溶，核酸類物質外泄導致pH發(fā)生變化.處理組3、4、5、8、9在反應120 h后pH為5.4～5.9，趨于一致. 這表明在中溫(38 ℃)條件下，抗酸化復合菌劑可以有效調控體系的pH波動，初始pH對發(fā)酵過程中pH的影響不顯著.

圖1 正交試驗中各試驗組pH隨時間的變化情況Fig.1 Changes in pH over time for each experimental group in the orthogonal test

2.2 淀粉和溶解性碳水化合物的變化

功能菌劑協(xié)同降解餐廚垃圾過程中，餐廚垃圾中的淀粉會在微生物作用下轉化為易于土壤利用的溶解性碳水化合物，從而達到提高肥力的效果. 如圖2所示，各處理組中淀粉轉化率均高于30%. 其中，處理組3中淀粉濃度的降幅較大，為99.12%，溶解性碳水化合物濃度也達到了7.15 g/L. 因為米曲霉分泌淀粉酶活的較佳溫度為20～30 ℃，所以相同接種量的處理組6、9，淀粉轉化率分別為30.54%、52.55%，這可能是受溫度的影響. 在相同接種量條件下，20 ℃發(fā)酵的處理組3的淀粉轉化率高于38、55 ℃下的處理組6、9. 同樣地，20 ℃發(fā)酵下處理組4、8的淀粉轉化率分別略高于等接種量的處理組7、2、5. 處理組1淀粉轉化率為95.58%，可能是抗酸化復合菌劑中的芽孢桿菌在適宜條件下發(fā)揮了顯著的降解淀粉大分子的作用. 但處理組1溶解性碳水化合物濃度相較于反應初始時刻僅提高了31%，這與微生物利用還原糖、多糖等物質進行自身生命活動有關. 此外，溶解性碳水化合物會參與腐殖質形成的美拉德反應[24]等過程，這也會導致其濃度降低[16].

圖2 不同處理對淀粉轉化率及溶解性碳水化合物濃度的影響Fig.2 Effect of different treatments on starch conversion rate and dissolved carbohydrate concentration

2.3 蛋白質和游離氨基酸的變化

餐廚垃圾富含蛋白質，可利用功能微生物將其降解為游離氨基酸，增加小分子可溶物質的濃度. 功能菌劑協(xié)同降解餐廚垃圾過程中蛋白質和游離氨基酸的變化情況見圖3. 結果表明，9個處理組中蛋白質轉化率均高于18%. 其中處理組2在55 ℃下蛋白質轉化率最高，為58.97%，有研究表明，55 ℃時米曲霉酶源產(chǎn)物中蛋白酶活性較高[18]，具有較高的蛋白質轉化能力. 相同溫度下處理組6、7的蛋白質轉化率分別為48.29%和33.10%，這與處理組7的酶源產(chǎn)物接種量低于處理組6有關. 接種量最少的處理組1、4、7的蛋白質轉化率較低，其中處理組4最低，僅為18.01%.

圖3 不同處理對蛋白質轉化率及游離氨基酸濃度的影響Fig.3 Effect of different treatments on protein conversion rate and free amino acid concentration

游離氨基酸含量變化分析顯示，處理組1最高，且在反應至144 h時達到最高值(4.09 g/L)，是處理組2的1.6倍，推測38 ℃、菌劑接種量為1%的條件有利于米曲霉生長且蛋白酶穩(wěn)定性高，相比于其他條件更有利于蛋白質降解和游離氨基酸的賦存. 處理組2、6、8的中游離氨基酸濃度較低，可能是因為菌劑接種量達到了10%、20%，液態(tài)發(fā)酵過程中微生物大量繁殖，各種生化反應逐漸強烈，氨基酸作為營養(yǎng)成分，在發(fā)酵后期逐漸被消耗，因而游離氨基酸濃度下降.

2.4 方差分析

由表2可見，菌劑接種量對溶解性碳水化合物及游離氨基酸濃度均有顯著影響(P＜0.05)，溫度僅對游離氨基酸濃度有顯著影響(P＜0.05)，初始pH對二者的影響均不顯著(P＞0.05).

表2 液相指標方差分析Table 2 Analysis of variance

功能菌劑在餐廚垃圾的降解過程中起到主要作用，可有效促進物質轉化；溫度是微生物生長與產(chǎn)酶的重要影響因子，直接影響酶活性和物質降解效率.因此，影響餐廚垃圾降解的因素依次是菌劑接種量、溫度、初始pH.

2.5 功能菌劑協(xié)同降解餐廚垃圾過程中微生物群落組成與演替

餐廚垃圾降解反應系統(tǒng)是一個相對復雜的體系，微生物作為主要功能因素，種類繁多、數(shù)量巨大，環(huán)境因子的改變、復合菌劑的性質等都會對微生物的生命活動產(chǎn)生影響. 因此，要真正實現(xiàn)對餐廚垃圾降解工藝的優(yōu)化，提高處理能效，還需要對餐廚垃圾降解不同階段的微生物多樣性、群落結構等方面進行更加深入的研究，從而在微生物學的角度上揭示其降解機理.

2.5.1不同處理下微生物多樣性

所有樣品的覆蓋率均高于99.9%，表明測序深度足以真實反映樣品的微生物多樣性. 如表3所示，從Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)來看，E組和F組在反應過程中細菌群落多樣性均呈先降低后升高的趨勢，其中E組在反應144 h時(E144)多樣性最高. 從ACE和Chao1指數(shù)來看，E組在反應過程中細菌群落豐度逐漸降低，F(xiàn)組細菌群落豐度呈波動趨勢. 從Simpson指數(shù)來看，E組在反應至72 h時(E72)真菌物種多樣性最高；從Chao指數(shù)來看，E組反應至48 h時(E48)樣品中的真菌群落豐度最高，隨后逐漸降低(見表3).

表3 細菌及真菌豐富度和多樣性Table 3 Bacterial and fungal abundance and diversity

2.5.2不同處理下微生物群落組成

如圖4(a)所示，樣品在細菌門水平上的微生物主要有 Firmicutes和Proteobacteria，且所有樣品的Firmicutes相對豐度均在97.94%以上. Firmicutes和Proteobacteria可以降解底物中的物質，如纖維素、蛋白質、果膠等. 其中，F(xiàn)irmicutes由于其厚壁結構、潛在的水解能力而在群落中占據(jù)主導地位[25].

如圖4(b)所示，隨著反應的進行，E組Bacilli的相對豐度不斷升高，達到99.98%，表明Bacilli具有良好的適應能力.Bacilli可以將大分子(如纖維素淀粉和蛋白質)降解為小分子[26]，有利于餐廚垃圾的發(fā)酵. F0樣品在屬水平上的微生物主要由Bacilli和Terribacillus組成，相對豐度分別為30.99%、68.50%，在其他處理時間上，F(xiàn)組在屬水平上的微生物主要由Bacilli組成，相對豐度趨于99%.

如圖4(c)所示，E組和F組在真菌門水平上的微生物主要有Ascomycota和Basidiomycota. Ascomycota和Basidiomycota的作用包括降解有機質、產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物等，是生態(tài)系統(tǒng)中的重要分解者[27-29]. E48樣品中Ascomycota和Basidiomycota的相對豐度分別為41.07%、56.84%. 隨著試驗進行，E組中Ascomycota的相對豐度越來越高，在E144樣品中達到了97.35%.在F組中，F(xiàn)0樣品中Ascomycota的相對豐度為99.37%，隨著試驗進行，Ascomycota和Basidiomycota的相對豐度不斷波動，F(xiàn)72樣品中二者分別為31.29%、65.83%.

如圖4(d)所示，從屬水平對真菌進行分析，發(fā)現(xiàn)各處理組的真菌相對豐度差異性較大，E48組中未鑒定出的傘菌為優(yōu)勢菌屬，E72、E144、F0樣品中優(yōu)勢真菌均為曲霉屬，相對豐度分別為82.73%、95.28%、97.34%. F組中，只有F0樣品中優(yōu)勢菌屬為曲霉屬，相對豐度達到97.34%；F48、F72、F144樣品中菌屬復雜，推測55 ℃不適合曲霉屬生長，隨著試驗進行，曲霉屬不再是優(yōu)勢菌屬，其他各類菌屬大量繁殖.

圖4 不同處理下微生物群落的變化Fig.4 Changes in microbial communities under different treatments

2.5.3相關性分析

選擇溫度、初始pH、菌劑接種量、氨基酸、溶解性碳水化合物等與微生物相對豐度做Pearson相關性分析. 由圖5可見，在環(huán)境因子與微生物群落之間的關系中，溫度、初始pH、菌劑接種量與優(yōu)勢微生物相對豐度存在顯著的正或負相關關系，且溫度、菌劑接種量與微生物相對豐度之間呈現(xiàn)一致的相關性.

圖5 環(huán)境因子與微生物群落的響應關系Fig.5 Responses between environmental factors and microbial communities

由圖5可見，Bacillus、Aspergillus的相對豐度與游離氨基酸濃度之間具有較強的相關性.Bacillus可通過分泌的蛋白酶、肽酶等將蛋白質分解為游離氨基酸，Bacillus相對豐度與游離氨基酸濃度之間的相關系數(shù)為0.452 4，降解過程中Bacillus對游離氨基酸濃度的升高有著重要作用. 有學者[30]發(fā)現(xiàn)，Aspergillus在黃酒發(fā)酵中具有較強的產(chǎn)酶能力，生成的蛋白酶會將蛋白質分解形成氨基酸.Bradyrhizobium是氮代謝的“樞紐”，是一種反硝化細菌，在生長過程中會利用消耗游離氨基酸[31]，所以二者相關系數(shù)小于-0.5.

除Bacillus與Aspergillus外，溶解性碳水化合物含量與其他菌屬相對豐度均呈正相關，其中與Agaricales、Cladosporium、Vibrio三種菌屬相對豐度的相關性較為顯著.Agaricales隸屬于Basidiomycota，能產(chǎn)生降解木質纖維素相關的碳水化合物活性酶和氧化還原酶，有研究[32]證明，Agaricales相關真菌都具有一定降解纖維素的潛力.Cladosporium可分泌內切葡聚糖酶[33]，對餐廚垃圾中蔬菜莖葉、果皮等具有較強的降解能力.Vibrio能產(chǎn)生葡萄糖苷酶、糖化酶，促進淀粉降解為葡萄糖等小分子碳水化合物[34].

3 結論

a) 溫度為38 ℃、初始pH為6.5條件下，抗酸化菌劑與米曲霉酶源產(chǎn)物等比例接種1%時，好氧發(fā)酵制備的液態(tài)有機肥游離氨基酸賦存最佳，淀粉和蛋白質轉化率分別達到94.49%和32.52%.

b) 微生物群落演替與代謝轉化的相關分析表明，Bacillus和Aspergillus作為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬，其相對豐度與游離氨基酸濃度之間具有較強的相關性，有效促進了蛋白質向游離氨基酸的轉化.Agaricales、Cladosporium、Vibrio在淀粉的降解和溶解性碳水化合物的賦存中起到重要作用.

c) 抗酸化菌劑和米曲霉酶源產(chǎn)物協(xié)同降解餐廚垃圾，制備富含氨基酸的液態(tài)有機肥，可用于土壤和作物改良，具有重要的應用價值.