外源褪黑素對鹽脅迫下苦菜幼苗生長的影響

郭愛華

(呂梁學院生命科學系，山西呂梁 033000)

苦菜(L.)為菊科(Compositae)苦苣菜屬()草本植物，是一種常在土壤休耕期間利用其儲存的寶貴水分進行生長的野生資源，原產于歐洲、非洲北部、亞洲，在我國大部地區均有分布。苦菜含有多種活性成分(黃酮類槲皮素、芹菜素、蕓香苷、脂肪酸、酚酸、糖苷、倍半萜內酯)及其苷類化合物、甾體，味甘略苦，既可作為蔬菜食用，又可作為中藥材治療疾病，具有較高的抗氧化及抑菌活性。研究發現，苦菜提取物對K562、HepG-2等腫瘤細胞有抑制作用，可防治癌癥，有顯著的鎮痛作用和良好的抗胃潰瘍、抗潰瘍性結腸炎活性。Su等研究發現，苦菜對臭氧較敏感，可作為臭氧的指示生物。由此可見，對苦菜資源的良好利用和開發是提高其經濟收益的有效措施。

人為作用引起的鹽漬化，又稱為次生鹽漬化，對土壤有不同程度的影響。目前，土壤鹽漬化日益嚴重，已經成為制約經濟植物發展的瓶頸，植物體內積聚鹽分后會影響植株形態建成，使光合作用降低、發生過氧化作用、膜系統損傷、滲透調節物質失去平衡等，對其有效改善和緩解已成為眾多學者面臨的嚴峻課題。褪黑素(melatonine，MT)，又名-乙酰基-5-甲氧基色胺(-acetyl-5-metoxytriptamine)，是一種重要的第二信使分子，在生物脅迫與非生物脅迫中起著各種作用。在甜瓜、番茄、甜葉菊等植物中，外源褪黑素能夠顯著促進其種子萌發及植株生長發育，通過修復線粒體，減輕活性氧、非生物和生物應激引起的細胞損傷，促進光合作用，最終提高植物的抗逆性。本研究旨在研究外源褪黑素對鹽脅迫后苦菜幼苗在生長發育、光合色素、膜質、抗氧化酶活性、滲透調節等方面的作用，為解決鹽漬化及進一步闡釋褪黑素的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

挑選籽粒飽滿的琪龍牌苦菜種子，浸種6 h后，擺放在鋪有2層濕紗布的培養皿中，每皿擺放30粒，在25 ℃培養箱中水培。

1.2 鹽脅迫處理

苦菜種子萌發后3 d，分別用0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液處理幼苗7 d，以清水處理為對照，根據根長、葉長、鮮質量、葉綠素含量，選擇脅迫較明顯的處理組的濃度作為后期鹽脅迫處理濃度。

1.3 褪黑素處理

幼苗鹽脅迫處理1周后加入0、25、50、75、100 μmol/L 外源褪黑素，處理5 d后檢測各項指標，每個處理重復3次。

1.4 指標的測定

選取長勢一致的3株幼苗，測量平均葉長、根長、鮮質量。

葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量的測定參考《植物生理學實驗指導》。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)測定；電導率的測定參考Wang等的方法；過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法；SOD活性采用酶聯免疫法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定；可溶性總糖含量采用蒽酮比色法進行測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法進行測定。

數據統計使用Excel 2010，作圖使用Origin 2019，數據分析用SAS 8e。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫處理對苦菜幼苗的影響

用不同濃度的鹽對苦菜幼苗進行脅迫處理，其根長、葉長、鮮質量及光合色素含量見圖1。可以看出，與未經鹽處理的幼苗相比，0.1、0.2 mol/L鹽處理可顯著提高幼苗根長、葉高、鮮質量、葉綠素a含量、葉綠素b含量。用0.3 mol/L鹽處理苦菜幼苗后，各項指標均下降，除鮮質量、葉綠素a含量外，包括類胡蘿卜素含量在內的各指標都與對照組間差異顯著，說明0.3 mol/L以上濃度的鹽會顯著影響苦菜幼苗的生長發育，但又不至于使植株完全失活，因此選用0.3 mol/L鹽脅迫處理幼苗進行后期試驗。

2.2 褪黑素對苦菜幼苗生長發育的影響

用0.3 mol/L鹽脅迫處理幼苗后，再用不同濃度的褪黑素處理。由圖2可以看出，25～50 μmol/L外源褪黑素可顯著提高幼苗根長、葉長、鮮質量，與0 μmol/L處理組相比，50 μmol/L處理組分別使幼苗根長、葉長、鮮質量提高了77%、35%、24%。用大于50 μmol/L濃度的褪黑素處理后，幼苗的生長指標降低。由此可見，由于苦菜幼苗較弱小，低濃度的外源褪黑素即可顯著促進其生長發育。

2.3 褪黑素對苦菜光合色素含量的影響

對褪黑素處理后的苦菜幼苗中的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素等光合作用色素的鮮質量含量進行測定。由圖3可見，幼苗中的葉綠素a、葉綠素b的鮮質量含量有先升高后下降的趨勢，在 50 μmol/L 褪黑素處理下，葉綠素a的鮮質量含量達到最大值(0.94 mg/g)，在75 μmol/L褪黑素處理下，葉綠素b的鮮質量含量達到最大值(0.66 mg/g)，且與50 μmol/L褪黑素處理組間的差異不顯著。類胡蘿卜素含量隨著褪黑素濃度的增大而增加，尤其是當褪黑素濃度大于50 μmol/L后，其含量顯著增加，與幼苗顯著變成黃色緊密相關。

2.4 褪黑素對苦菜膜質的影響

對外源褪黑素處理后的苦菜幼苗中的丙二醛含量、相對電導率進行測定。由圖4可見，二者均有先降低后升高的趨勢。較低濃度(如25 μmol/L)褪黑素處理即可顯著降低經鹽脅迫處理后苦菜幼苗的丙二醛含量、相對電導率，分別較對照顯著降低了4.9%、14.3%。50 μmol/L 褪黑素處理組的幼苗丙二醛含量、電導率分別顯著降低了10.3%、20.5%。75 μmol/L褪黑素處理的幼苗丙二醛含量和相對電導率均升高，其電導率與0 μmol/L褪黑素處理組間差異顯著。由此可見，低濃度褪黑素處理即可顯著提升質膜功能，以降低膜所受損傷。

2.5 褪黑素對苦菜抗氧化酶活性的影響

經褪黑素處理后的苦菜幼苗POD、SOD活性見圖5。當褪黑素濃度小于75 μmol/L時， POD、 SOD活性均顯著提高，其中當褪黑素濃度為50 μmol/L時，POD、SOD活性達到最大值，分別較對照組提高了36.6%、20.5%，并且與對照組之間差異顯著。當褪黑素濃度達到100 μmol/L時，2種抗氧化酶活性反而降低。

2.6 褪黑素對苦菜滲透調節的影響

從圖6可以看出，25、50 μmol/L褪黑素均可顯著提高可溶性蛋白含量，分別較0 μmol/L處理組增加了25.4%、34.1%。當褪黑素濃度大于75 μmol/L時，顯著降低了可溶性蛋白含量。當褪黑素濃度小于75 μmol/L時，顯著增加了苦菜幼苗的可溶性糖含量，其增幅在4.0%～29.5%之間。不同濃度褪黑素對苦菜幼苗脯氨酸含量的影響呈現先升高再降低的趨勢，濃度小于75 μmol/L的褪黑素處理均提高了脯氨酸含量，并且不同處理組之間差異顯著。當褪黑素濃度達到100 μmol/L時，不僅顯著降低了可溶性蛋白、可溶性糖含量，并且顯著降低了脯氨酸含量。

2.7 不同濃度褪黑素對各測定指標影響的相關性

由表1可以看出，植物生長指標根長與葉長、鮮質量、葉綠素a含量、葉綠素b含量均呈顯著正相關；類胡蘿卜素、丙二醛、電導率與生長發育指標呈較大的負相關；抗氧化酶活性及滲透調節物質含量基本與生長發育指標呈顯著正相關。

表1 各檢測指標之間的相關性分析

3 討論

苦菜作為藥食同源的野生植物資源，具有綠色、天然、環保等優點，而且其商業開發價值較高，種子萌發時對溫度范圍的要求廣泛，在5～35 ℃均可萌發，其生長對環境條件的要求不高，春、夏、秋季均可獲取，而且可作為環境指示生物之一。苦菜在中藥材方面的應用已有2 000多年的歷史，由于其含有低分子抗氧化劑(萜類、黃酮、酚酸、甾體等)中草藥成分，因此相關臨床研究逐漸增多，為揭示其分子機制奠定了基礎。

用0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液處理苦菜幼苗后，通過對其根長、葉長、鮮質量、葉綠a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量等指標的檢測，發現低濃度鹽可促進植株生長，大于0.3 mol/L濃度的NaCl溶液對苦菜幼苗的脅迫作用較顯著。植物響應鹽脅迫可通過多種生化和分子機制，在植株上表現為控制離子運輸、光合途徑以及抗氧化酶活性、植物激素水平、膜質成分等方面的變化。緩解鹽脅迫是提高經濟植物產量、進行有效開發利用的前提和保證。

大量研究發現，褪黑激素在植物對鹽脅迫的反應中起著重要作用。本研究使用不同濃度褪黑素對鹽脅迫后的苦菜幼苗進行處理，發現在生長發育及生理方面，褪黑素可有效緩解幼苗遭受的鹽脅迫；25 μmol/L褪黑素即可調節膜質物丙二醛及其相對電導率，增強其抵抗力，降低膜損傷；上調抗氧化酶活性，以消除活性氧物質；增強滲透調節功能，有效改善滲透不平衡現象，防止細胞脫水。這與外源褪黑素處理提高鹽脅迫后玉米幼苗的結果相似，此外，褪黑素還可有效抵抗多種生物及非生物脅迫，如重金屬、干旱脅迫等。褪黑激素主要通過2種途徑增強植物對鹽脅迫的抗性，一種是通過直接途徑，如直接清除活性氧，另一種是通過間接途徑提高抗氧化酶活性、光合效率和代謝物含量，以及調節與脅迫相關的轉錄因子。