酶聯(lián)免疫法測(cè)定豬尿中克倫特羅殘留的檢測(cè)與分析

曹忠君

（鐵嶺市畜產(chǎn)品安全檢測(cè)站，遼寧 鐵嶺 112000）

在現(xiàn)代化畜牧業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中，普遍存在著用于提高經(jīng)濟(jì)動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)量的藥物及違禁品被廣泛濫用的現(xiàn)象，鹽酸克倫特羅就是其中最常用的一種。它屬于擬腎上腺素類藥物，被人們意外發(fā)現(xiàn)鹽酸克倫特羅可明顯促進(jìn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生長(zhǎng)，顯著提高瘦肉率。能夠促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)，特別是機(jī)體蛋白質(zhì)的合成，阻礙脂肪的形成，從而改善肉品質(zhì)，所以鹽酸克倫特羅又稱為“瘦肉精”。大量試驗(yàn)證明，鹽酸克倫特羅在動(dòng)物體內(nèi)蓄積殘留的主要器官和組織是，肝、眼睛、肌肉、肺、毛發(fā)、腎和脂肪組織。藥物殘留對(duì)環(huán)境、人體健康、畜牧業(yè)健康發(fā)展等方面影響極大。近年來(lái)，我國(guó)政府及相關(guān)部門(mén)對(duì)獸藥的科學(xué)用藥和殘留檢測(cè)極為重視，因此應(yīng)重視對(duì)鹽酸克倫特羅的檢測(cè)。

本研究旨在探討應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)豬尿中克倫特羅殘留的方法，同時(shí)也為了監(jiān)測(cè)某地區(qū)屠宰的生豬克倫特羅殘留的現(xiàn)狀。結(jié)果表明，該方法具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、檢測(cè)成本不高的特點(diǎn)，本次試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)全部合格。本方法適用于大批量檢測(cè)，便于基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)以及屠宰企業(yè)應(yīng)用，能夠起到監(jiān)測(cè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物藥物使用情況的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

DNM9602G型酶標(biāo)分析儀(配備450納米濾光片)；CF160RXⅡ型高速立式冷凍離心機(jī)；恒溫培養(yǎng)箱（可調(diào)至25℃）；可調(diào)式移液器（規(guī)格為50微升、300微升、1000微升）；八道移液器（規(guī)格為300微升）；移液器吸頭50微升、300微升、1000微升；吸水紙。

1.2 試劑和材料

除應(yīng)具有實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿和實(shí)驗(yàn)用水（應(yīng)符合GB/T 6682中一級(jí)水的要求）外，還應(yīng)準(zhǔn)備克倫特羅酶聯(lián)免疫試劑盒，應(yīng)保存于2～8℃冰箱中，試劑盒應(yīng)包括如下試劑耗材。

（1）96孔板(12條×8孔)包被有針對(duì)克倫特羅IgG的包被抗抗體。（2）克倫特羅系列標(biāo)準(zhǔn)品樣液(至少有5個(gè)倍比稀釋濃度水平，附加1個(gè)空白對(duì)照)。（3）克倫特羅抗體(濃縮液)和過(guò)氧化物酶標(biāo)記物(濃縮液)。（4）發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）和酶底物（過(guò)氧化尿素）。（5）緩沖液（酶標(biāo)記物及抗體濃縮液稀釋用）和反應(yīng)終止液（1摩爾/升硫酸）。

競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)記物的稀釋：提供的競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)記物為濃縮液。由于稀釋的酶標(biāo)記物不穩(wěn)定，僅需稀釋實(shí)際用量的酶標(biāo)記物。用緩沖液以1∶10的比例稀釋酶標(biāo)記物濃縮液(如400微升濃縮液+3.6毫升緩沖液，足夠4個(gè)微孔板條32孔用)。

克倫特羅抗體的稀釋：克倫特羅抗體濃縮液穩(wěn)定適合長(zhǎng)期放置，由于稀釋的克倫特羅抗體穩(wěn)定性變差，僅需稀釋實(shí)際需要用量的克倫特羅抗體即可。用緩沖液以1∶10的比例稀釋抗體濃縮液(如400微升濃縮液+3.6毫升緩沖液，足夠4個(gè)微孔板條32孔用)。

包被有抗抗體的微孔板條的使用：將錫箔袋沿橫向邊壓皺外沿剪開(kāi)，取出需用數(shù)量的微孔板放置在框架上，將剩余的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于4℃冰箱中。

1.3 方法

樣品制備：尿液清澈可直接上樣，若渾濁先離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，備用。

試驗(yàn)步驟：（1）使用前使試劑和材料恢復(fù)到室溫。（2）將標(biāo)準(zhǔn)和試樣所用數(shù)量的孔條插人微孔架。（3）加入100微升準(zhǔn)確稀釋好的抗體溶液到每一個(gè)微孔中，充分混合并在室溫（或放置25℃培養(yǎng)箱中）孵育15分鐘。（4）倒出所有孔中的液體，倒置在吸水紙上拍打(每行拍打4次)，用力應(yīng)均勻，防止用力過(guò)大甩出孔條。用250微升實(shí)驗(yàn)用水充入孔中，輕輕搖晃后倒出微孔中液體，再重復(fù)操作3遍以上。（5）加入20微升的處理好的尿液或標(biāo)準(zhǔn)到微孔中，試樣和標(biāo)準(zhǔn)至少做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。（6）加入100微升已經(jīng)稀釋過(guò)的酶標(biāo)記物，25±2℃孵育30分鐘。（7）全部倒出孔中的混合液體，在吸水紙上拍打(每行拍打4次)。用250微升實(shí)驗(yàn)用水充入孔中，倒出微孔中液體，再重復(fù)操作3次以上。（8）迅速加入50微升酶底物和50微升發(fā)色試劑到微孔中，室溫孵育15分鐘。（9）加入100微升停止液到每個(gè)微孔中，盡快在450納米波長(zhǎng)處的酶標(biāo)分析儀測(cè)量，微孔加停止液后為深淺不同的黃色，顏色越淺表示克倫特羅含量越高。

結(jié)果計(jì)算：

先計(jì)算相對(duì)吸光度值。按下式計(jì)算：

相對(duì)吸光度值(%)=B/B×100

式中：

B——標(biāo)準(zhǔn)(或試樣)溶液的吸光度值；

B——空白(濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的吸光度值。

式中：

——試樣中克倫特羅的含量，單位為微克每千克(或微克每升)。

——試樣吸光度值(%)對(duì)應(yīng)的克倫特羅量，單位為微克每升。

——試樣的稀釋倍數(shù)。

——試樣的取樣量，單位為克(或毫升)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

由圖1可以看出相關(guān)系數(shù)R=0.9998，表明吸光度和克倫特羅含量濃度線性相關(guān)性高，標(biāo)準(zhǔn)品使用準(zhǔn)確，酶標(biāo)分析儀性能正常、調(diào)試良好。

圖1 酶聯(lián)免疫法測(cè)定克倫特羅含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法回收率分析

本研究共進(jìn)行10次實(shí)驗(yàn)，為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確度，每次實(shí)驗(yàn)附帶一批次空白樣品和兩批次質(zhì)控樣品，添加回收濃度為，1微克/升和2微克/升，其回收率均在74.3%～109.7%，說(shuō)明尿液中克倫特羅成分損失小，酶聯(lián)免疫試劑盒試劑材料有效，檢測(cè)方法、實(shí)驗(yàn)操作步驟正確，測(cè)試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、真實(shí)。

2.3 樣品結(jié)果分析

檢測(cè)結(jié)果顯示，從某地區(qū)不同屠宰場(chǎng)隨機(jī)抽取的100批次豬尿樣品中克倫特羅含量均未超過(guò)酶聯(lián)免疫試劑盒檢出限，合格率為100%。

3 討論

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)藥物殘留成本低、特異性高，適合大批量樣品檢測(cè)，實(shí)用性強(qiáng)。筆者根據(jù)檢驗(yàn)檢測(cè)工作多年經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)以下幾點(diǎn)該檢測(cè)方法操作注意事項(xiàng)供基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和屠宰企業(yè)檢測(cè)人員參考：（1）當(dāng)今酶聯(lián)免疫試劑盒生產(chǎn)廠家很多，應(yīng)加以考察和質(zhì)量驗(yàn)證，使用質(zhì)量符合要求的產(chǎn)品。（2）每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)同時(shí)做空白對(duì)照和陽(yáng)性添加對(duì)照，做好質(zhì)量控制，且做平行樣品。

（3）完全按照其步驟操作，不可省略、顛倒步驟。（4）試劑盒使用前，將試劑盒內(nèi)各組份置于室溫，待其恢復(fù)至室溫（25±2℃），方可使用。使用后請(qǐng)立即將試劑及包被有抗抗體的微孔板條放回 2～8℃冰箱中保存，但也不要反復(fù)恢復(fù)室溫再冷藏（一般建議酶聯(lián)免疫試劑盒3次實(shí)驗(yàn)內(nèi)用完），否則吸光度值下降，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度下降。（5）各試劑在使用前需搖勻，濃縮液一定注意稀釋后使用。（6）檢測(cè)時(shí)，應(yīng)盡量減少板孔上方空氣流動(dòng)，加入試劑應(yīng)迅速且準(zhǔn)確。（7）不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，防止污染及反應(yīng)。（8）移液器吸取試劑時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，否則試劑加入量不準(zhǔn)確，有氣泡應(yīng)推出液體重新吸取。（9）終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。