雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖、凋亡和炎癥的影響及其調控機制

吳建霞，王越，薛豐田，陶玲玲

河南大學附屬鄭州頤和醫院，鄭州 450047

糖尿病腎病是糖尿病常見的并發癥之一。高糖可誘導足細胞損傷，從而加快糖尿病腎病病情進展。高糖引起的炎癥反應等可誘導足細胞凋亡，進而加重足細胞損傷。既往研究顯示［1-3］，木犀草素等成份具有抗炎等作用，可減輕高糖誘導的足細胞損傷，從而減輕腎臟損傷。雷公藤多苷含有生物堿等活性成份，具有抗炎、抗癌等作用，可減輕脂多糖誘導的星形膠質細胞炎癥損傷［4］。但雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞損傷的影響及其可能作用機制尚未闡明。微小核糖核酸（miRNA）是長度為20～25 個核苷酸的非編碼核糖核酸（RNA）分子，以堿基互補配對的方式與靶基因結合，可調控靶基因表達，在糖尿病腎病中異常表達并可參與足細胞損傷過程［5］。miR-150-3p 屬于短鏈非編碼RNA分子，其在糖尿病腎病中表達上調，可能與糖尿病腎病的發病機制有關［6］，但miR-150-3p 能否作為雷公藤多苷治療糖尿病腎病的潛在靶標尚未可知。本研究采用高糖誘導人腎足細胞建立細胞損傷模型，探討雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖、凋亡、炎癥的影響及其對miR-150-3p 的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤多苷（純度>98%）購自湖南千金協力藥業有限公司；人腎足細胞購自上海澤葉生物科技有限公司；DMEM 培養基購自美國Gibco 公司；miR-inhibitor-NC、miR-150-3p inhibitor、miR-mimics-NC、miR-150-3p mimics 購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax 抗體購自美國Santa Cruz 公司；HRP標記山羊抗兔IgG 二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

Lipofectamine 2000 轉染試劑、Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；RevertAid RT 逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；MTT 試劑、凋亡檢測試劑購自美國Sigma 公司；超敏C 反應蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP）、白 細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 分組

人腎足細胞于含5mmol/L 葡萄糖的培養液中培養48h，作為Control 組。人腎足細胞于含30mmol/L 葡萄糖的培養液中培養48h［7］，作為HG 組。人腎足細胞分別于含30mmol/L 葡萄糖和不同濃度（30、60、90mg/ml）雷公藤多苷的培養液中培養48h［8］，分別作為HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90 組。將不含胎牛血清的細胞培養液與miR-inhibitor-NC、miR-150-3p inhibitor 混合后室溫孵育5min（A 液），Lipofectamine 2000 轉染試劑與不含胎牛血清的細胞培養液充分混合（B 液），A 液與B 液充分混勻后室溫孵育20min，并將其加入人腎足細胞，轉染6h 棄上清液后更換含30mmol/L 葡萄糖的培養液繼續培養48h，分別記為HG+miR-inhibitor-NC 組、HG+miR-150-3p inhibitor 組。按照上述方法將miR-mimics-NC、miR-150-3p mimics轉染至人腎足細胞后加入含30mmol/L 葡萄糖與90mg/ml 雷公藤多苷的培養液中培養48h，分別記為HG+Tri-90+miR-mimics-NC 組、HG+Tri-90+miR-150-3p mimics 組。

1.3 MTT 法檢測細胞增殖

取人腎足細胞（1×105個/ml）接種于96 孔板（100μl/孔），按照“1.2”方法分組處理后加入MTT 溶液（20μl/孔）與二甲基亞砜（150μl/孔），充分混勻后室溫孵育5min，并檢測細胞吸光度（OD）值。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

取各組人腎足細胞加入預冷磷酸緩沖鹽溶液，采用BY-80C 型臺式低速離心機（濟南來寶醫療器械有限公司）3000r/min 轉速離心6min 后棄上清液，加入500μl 結合緩沖液重懸細胞，隨后加入5μl Annexin V-FITC 與5μl 碘化丙啶（PI），充分混勻后室溫孵育10min，應用FACS Calibur 流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 ELISA 法檢測hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平

取各組人腎足細胞培養上清液，采用ELISA法檢測hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 qRT-PCR 法檢測miR-150-3p 表達水平

采用Trizol 法提取各組人腎足細胞總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA 濃度后置于-80℃超低溫冰箱內保存。反轉錄體系：RNA 2μl，10×RT Buffer 2μl，dNTP 0.4μl，Multiscripe RT 1μl，10×Random Primer 2μl，RNase-Free ddH2O 補足體系至20μl。反應條件：25℃，10min；37℃，60min；95℃，5min；4℃保存。qRT-PCR擴 增 體 系：10×PCR Buffer 2.5μl，MgSO42.5μl，dNTPs 2.5μl，正、反向引物各0.5μl，cDNA 2μl，RNase-Free ddH2O 補足體系至25μl。反應條件：95℃預變性2min，95℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共36 次循環。采用qRT-PCR 熒光定量數據分析法計算miR-150-3p 的表達量。

1.7 Western blot 法檢測CyclinD1、Bcl-2、 P21、Bax 蛋白水平

提取各組人腎足細胞總蛋白后檢測蛋白濃度，加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮10min 后蛋白變性，將50μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳分離，并將其轉移至PVDF 膜，室溫封閉2h，加入一抗稀釋液（CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax 與內參β-actin 1︰1000）后孵育過夜（4℃），使用TBST 洗滌后加入二抗稀釋液（1︰2000），室溫孵育1h 后滴加ECL 顯影，應用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖的影響

與Control 組比較，HG 組OD 值、CyclinD1 蛋白水平降低，P21 蛋白水平升高（P<0.05）。與HG 組比較，HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90組OD 值、CyclinD1 蛋白水平升高，P21 蛋白水平降低（P<0.05）。見表1 和圖1。

圖1 增殖相關蛋白表達

表1 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖的影響 n=9，

表1 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖的影響 n=9，

與Control 組比較，a：P<0.05；與HG 組比較，b：P<0.05

2.2 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響

與Control 組比較，HG 組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05）。見表2 和圖2。

圖2 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響

表2 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

表2 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

與Control 組比較，a：P<0.05；與HG 組比較，b：P<0.05

2.3 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞中miR-150-3p 表達水平的影響

與Control 組比較，HG 組miR-150-3p 表達水平升高（P<0.05）。與HG 組比較，HG+Tri-30 組、HG+Tri-60 組、HG+Tri-90 組miR-150-3p 表達水平降低（P<0.05）。見表3。

表3 雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞中miR-150-3p 表達水平的影響

2.4 沉默miR-150-3p 對高糖誘導的人腎足細胞增殖的影響

與Control 組比較，HG+miR-inhibitor-NC組OD 值、CyclinD1 蛋白水平降低，miR-150-3p 表達水平、P21 蛋白水平升高（P<0.05）。與HG+miR-inhibitor-NC 組比較，HG+miR-150-3p inhibitor 組OD 值、CyclinD1 蛋白水平升高，miR-150-3p 表達水平、P21 蛋白水平降低（P<0.05）。見表4 和圖3。

表4 沉默miR-150-3p 對高糖誘導的人腎足細胞增殖的影響 n=9，

表4 沉默miR-150-3p 對高糖誘導的人腎足細胞增殖的影響 n=9，

與Control 組比較，a：P<0.05；與HG+miR-inhibitor-NC 組比較，b：P<0.05

圖3 增殖相關蛋白

2.5 沉默miR-150-3p 對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響

與Control 組比較，HG+miR-inhibitor-NC組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05）。與HG+miR-inhibitor-NC 組比較，HG+miR-150-3p inhibitor 組凋亡率、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05）。見表5 和圖4。

圖4 沉默miR-150-3p 對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響

表5 沉默miR-150-3p 對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

表5 沉默miR-150-3p 對高糖誘導的人腎足細胞凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

2.6 過表達miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響

與HG+Tri-90+miR-mimics-NC 組比較，HG+Tri-90+miR-150-3p mimics 組OD 值和CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平降低，miR-150-3p表達水平、凋亡率、P21、Bax 蛋白水平以及hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.05）。見表6和圖5。

圖5 過表達miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響

表6 過表達miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

表6 過表達miR-150-3p 減弱雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖、凋亡和炎癥因子的影響 n=9，

3 討論

炎癥、氧化應激可引起足細胞損傷，因而如何抑制炎癥及其引起的細胞凋亡成為研究重點，表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯通過抑制內質網應激而抑制高糖誘導的足細胞凋亡［9］。葛根素通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）的表達而減輕足細胞損傷［10］。目前，雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞損傷的作用機制尚未闡明。

雷公藤多苷屬于中藥雷公藤的提取物，具有抗炎、抗免疫等作用，可保護腎臟，但其作用機制尚未闡明［11-12］。本研究結果顯示，高糖誘導的人腎足細胞活力降低，而雷公藤多苷可提高高糖誘導的人腎足細胞活力。CyclinD1 與P21 可調控細胞周期而調節細胞增殖過程［13］。本研究進一步分析發現，高糖誘導的人腎足細胞中CyclinD1 的表達下調，P21 的表達上調，而雷公藤多苷可提高CyclinD1的表達水平及降低P21 的表達水平。提示雷公藤多苷可促進高糖誘導的人腎足細胞增殖。Bcl-2 屬于抗凋亡蛋白；Bax 屬于促凋亡蛋白，可激活線粒體途徑而誘導細胞凋亡［14］。本研究結果顯示，高糖誘導的人腎足細胞凋亡，抑制Bcl-2 的表達及促進Bax 的表達，而雷公藤多苷可降低高糖誘導的人腎足細胞凋亡，并可促進Bcl-2 的表達及抑制Bax的表達。提示雷公藤多苷可抑制高糖誘導的人腎足細胞凋亡。糖尿病腎病患者存在全身性炎癥反應，hs-CRP、IL-1β、TNF-α的水平升高可促進糖尿病腎病發展［15］。本研究結果顯示，高糖誘導的人腎足細胞hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平升高，而雷公藤多苷可降低高糖誘導的人腎足細胞hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平。提示雷公藤多苷可抑制高糖誘導的人腎足細胞炎癥反應。

為進一步探究雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞損傷的作用機制，本研究結果顯示，高糖誘導的人腎足細胞中miR-150-3p 的表達水平升高，而雷公藤多苷可降低高糖誘導的人腎足細胞中miR-150-3p 的表達水平。提示雷公藤多苷可能通過抑制miR-150-3p 的表達，從而參與人腎足細胞損傷過程。miR-150-3p 在大鼠肺損傷中呈高表達，可能參與肺損傷發生過程［16］。miR-150 表達下調可保護腎臟免受心肌梗死引起的急性腎損傷［17］。本研究結果顯示，沉默miR-150-3p 可提高高糖誘導的人腎足細胞活力，并可降低細胞凋亡率，還能降低hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平。提示沉默miR-150-3p 可促進高糖誘導的人腎足細胞增殖及抑制細胞凋亡、炎癥反應。同時本研究結果顯示，miR-150-3p 過表達可減弱雷公藤多苷對高糖誘導的人腎足細胞增殖、凋亡和炎癥反應的作用。

綜上所述，雷公藤多苷可能是通過降低miR-150-3p 的表達水平而促進細胞增殖及抑制細胞凋亡、炎癥反應，從而減輕高糖誘導的人腎足細胞損傷。miR-150-3p 可能是雷公藤多苷減輕高糖誘導的人腎足細胞損傷的作用靶點，本研究為進一步揭示雷公藤多苷治療糖尿病腎病的分子機制奠定了基礎。