頂空氣相色譜法測定生脈注射液中甲醛和乙醛的含量

金偉斌，陳禮峰，唐倩倩，顧曉風*

1 蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104；2 山東綠葉制藥有限公司，煙臺 264670

生脈注射液根據我國古驗方生脈散研制，由紅參、麥冬和五味子的提取物配制而成，具有擴張血管、增加冠脈血流量、抗休克、抗心絞痛等作用，是臨床上常用的補益類中藥注射液［1-2］。生脈注射液中含3～5g/L 的聚山梨酯80，聚山梨酯80 是制備注射劑的常用輔料，具有增溶和乳化的作用［3-4］。聚山梨酯80 為含聚氧乙烯鏈的聚合物，在其自氧化過程中會產生甲醛和乙醛等小分子雜質［5］。甲醛和乙醛是細胞原漿毒物，為眾多疾病的誘因，嚴重危害人體健康，國際癌癥研究所、美國環境保護局及世界衛生組織確認其為對人體有毒害、致癌、致畸作用的化學物質和環境污染物［6-7］。然而，國內外藥典標準中均未對聚山梨酯80 的醛類雜質進行控制；對于添加了聚山梨酯80 的制劑，對其降解產物甲醛和乙醛的測定也未見報道。本實驗參考疫苗、地表水、紙張等［7-9］中甲醛的檢測方法，基于頂空氣相色譜法，建立生脈注射液中甲醛、乙醛的含量測定方法，以用于高風險制劑的安全性控制。

1 材料

1.1 儀器

7890A 氣相色譜儀（Agilent Open Lab Acquisition 2.4 工作站、7697A 頂空進樣器，安捷倫科技有限公司）；XS205DU 型電子天平（梅特勒托利多集團）。

1.2 試藥

水中甲醛溶液標準物質（國家標準物質資源共享平臺，批號：L4A1，100μg/ml）；乙醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：190159-201802，純度99.3%）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司，批號：20210301）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180509）；生脈注射液（公司A，批號：2004101、2004031、2002161、1903221、1901141、2012221）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent HP-INNOWAX 毛細管色譜柱（30m×0.32mm，0.5μm）。程序升溫，起始溫度為45℃，保持10min，以30℃/min 的速率升至200℃，保持2min；進樣口溫度為200℃，分流比為10∶1；檢測器為氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID），溫度為250℃；載氣為高純氮，流速為1.0ml/min；頂空進樣平衡溫度為80℃，平衡時間20min，進樣時間1min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液

取水中甲醛溶液標準物質和乙醛對照品適量，加純凈水稀釋成甲醛、乙醛的濃度分別為50.0μg/ml和120.5μg/ml 的混合對照品儲備液。

2.2.2 對照品溶液

精密量取“2.2.1”項下對照品儲備液1ml，置于50ml 量瓶中，加純凈水稀釋至刻度，搖勻。取20ml 頂空瓶，加入1g 氯化鈉，再精密量取5ml 上述稀釋液置于瓶中，加蓋密封，即得甲醛、乙醛濃度分別為1.00μg/ml 和2.41μg/ml 的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液

精密量取生脈注射液5ml，置于已放入1g 氯化鈉的20ml 頂空瓶中，加蓋密封，即得供試品溶液。

2.2.4 空白對照溶液

精密量取純凈水5ml，置于已放入1g 氯化鈉的20ml 頂空瓶中，加蓋密封，即得空白對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗

取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各5ml，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，色譜圖見圖1。甲醛和乙醛峰的理論板數均大于20 000，拖尾因子均小于1.2，與相鄰雜峰的分離度大于3.0，表明供試品溶液和空白對照溶液中的其他物質對甲醛、乙醛測定無干擾。

圖1 空白對照溶液（A）、對照品溶液（B）和供試品溶液（C）的氣相色譜圖

2.3.2 精密度試驗

平行配制對照品溶液6 份，甲醛和乙醛峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.76%和0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗

取同一供試品（批號：1903221）6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。按外標法計算甲醛和乙醛的含量分別為0.93μg/ml 和2.84μg/ml，RSD 分 別 為2.48% 和1.53%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗

平行配制5 份對照品溶液，分別于0、6、12、18、24h 進樣，甲醛和乙醛峰面積的RSD 分別為1.44%和1.07%，表明甲醛和乙醛在24h 內穩定性良好。

2.3.5 線性關系、定量限和檢測限

取“2.2.1”項下對照品儲備液適量，加純凈水稀釋成甲醛質量濃度分別為0.10、0.25、0.50、0.80、1.00、2.00μg/ml，乙醛質量濃度分別為0.24、0.60、1.20、1.93、2.41、4.82μg/ml 的系列標準溶液。分別精密量取5ml，置于已放入1g 氯化鈉的20ml 頂空瓶中，加蓋密封，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。甲醛和乙醛在各自范圍內線性關系良好，見表1。

以信噪比約為3∶1 的質量濃度作為檢測限（limit of detection，LOD）；以信噪比約為10∶1的質量濃度作為定量限（limit of quantification，LOQ）。見表1。

表1 甲醛和乙醛的線性關系、定量限和檢測限

2.3.6 加樣回收率試驗

精密量取對照品儲備液0.6、1.0、1.4ml，分別置于50ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制得甲醛濃度分別為0.6、1.0、1.4μg/ml 和乙醛濃度分別為1.45、2.41、3.37μg/ml 的對照品溶液。取9個頂空瓶，各加入1g 氯化鈉，分別精密加入生脈注射液（批號：1903221）2.5ml。9 份樣品分成3組，每組分別精密加入上述3 個濃度的對照品溶液2.5ml，搖勻，加蓋密封，進樣檢測，計算平均加樣回收率，結果見表2。

表2 甲醛和乙醛的加樣回收率試驗結果

2.4 樣品測定

取6 批樣品，按“2.2.3”項下方法各平行制備3 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以外標法計算樣品中甲醛和乙醛的含量，結果見表3。

表3 樣品中甲醛和乙醛的含量測定結果 n=3，μg/ml

3 討論

3.1 測定方法選擇

《中國藥典》2020 年版［10］中對醛類雜質的檢查方法多為比色法、紫外-可見光分光光度法，二者專屬性差，且均為半定量方法，不利于藥品的安全性評估。《美國藥典》（USP42-NF37）中基于高效液相色譜（HPLC）、采用柱前衍生化法測定聚乙二醇 3350 中甲醛和乙醛的含量［11］，也有研究報道參照該方法測定聚山梨酯類輔料中的醛類物質［6］。由于中藥注射液成份復雜，本研究采用柱前衍生化HPLC 法建立生脈注射液中甲醛和乙醛的含量測定方法時，色譜峰干擾較多，且目標物峰與其他雜峰未能完全分離。頂空氣相色譜法將液體樣品中的揮發性組份直接導入氣相色譜儀進行分離和檢測，無需對樣品進行前處理，受樣品基質干擾小，在測定液體樣品中的揮發性雜質方面應用廣泛［12-13］，故認為采用頂空氣相色譜法測定生脈注射液中甲醛和乙醛的含量更為適宜。

3.2 色譜條件優化

本研究考察了HP-5（30m×0.32mm，0.25μm）、HP-FFAP（30m×0.32mm，0.5μm）、HPINNOWAX（30m×0.32mm，0.5μm）、DB-WAX（30m×0.32mm，0.5μm）4 種毛細管色譜柱。其中，HP-5（30m×0.32mm，0.25μm）無法完全分離甲醛、乙醛和相鄰雜峰；HP-INNOWAX（30m×0.32mm，0.5μm）、HP-FFAP（30m×0.32mm，0.5μm）和DB-WAX（30m×0.32mm，0.5μm）均能完全分離目標物峰，且HP-INNOWAX（30m×0.32mm，0.5μm）獲得的甲醛色譜峰響應值最高，峰形最為對稱尖銳，故選擇HP-INNOWAX（30m×0.32mm，0.5μm）毛細管色譜柱。

本研究考察了分流比對峰形的影響。當分流比為2∶1 時，目標物峰對稱因子為0.8，理論板數較低；分流比為20∶1 時，峰形尖銳對稱。為了兼顧靈敏度和峰形，最終選擇分流比為10∶1。

本研究考察了柱溫對色譜峰的影響。起始溫度為50℃和60℃時，甲醛峰與相鄰雜峰分離度較小，故起始溫度設為45℃；考慮到樣品中可能存在高沸點物質，采用程序升溫方式，便于其他雜峰流出色譜系統。

在水相中加入適量無機鹽，可增加溶液離子強度，降低水中甲醛、乙醛的溶解度，有利于提高分析靈敏度。本研究考察了不加氯化鈉、加1g 氯化鈉、加2g 氯化鈉對色譜峰的影響。結果表明，加氯化鈉后的甲醛、乙醛峰都明顯增大，靈敏度提高，且加1g 或2g 氯化鈉并無明顯差異，故選擇加1g 氯化鈉。

3.3 生脈注射液中甲醛、乙醛的含量

本研究對6 批生脈注射液樣品進行了測定，均檢測出甲醛和乙醛。甲醛含量在0.26～1.28μg/ml范圍內，乙醛含量在1.52～3.59μg/ml 范圍內，且不同批次產品中的甲醛和乙醛含量差異較大，這可能與不同批次產品所用聚山梨酯80 批次不同有關。此外，按照自氧化反應的發生機制，隨著樣品貯藏時間延長，甲醛和乙醛含量也可能會增加。

4 小結

《中國藥典》2020 年版對藥用輔料聚山梨酯80中醛類物質未作控制，而聚山梨酯80 在中藥注射劑中應用廣泛，某些品種中其含量達到20g/L［14］，關注制劑中甲醛和乙醛含量對安全用藥有重要意義。本研究建立了基于頂空氣相色譜法的生脈注射液中甲醛、乙醛含量測定方法，該方法操作簡單，靈敏度高，準確度高，可用于生脈注射液的質量控制。