結直腸癌患者血漿cfDNA檢測方法的建立及臨床應用評估

朱赟潔， 馬崢堯， 沈敏娜， 周 琰， 黃 斐， 陳馨寧， 張春燕， 王蓓麗， 郭 瑋

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

結直腸癌是一種好發于老年男性人群的惡性腫瘤，發病率居所有惡性腫瘤的第3位，病死率居第2位，其發病率與年齡有關，但近年來有年輕化的趨勢[1]。有研究發現，有35%～45%的結直腸癌患者存在KRAS基因突變，約有15%的轉移性結直腸癌患者存在BRAF基因突變，約有5%的結直腸癌是由微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）高或錯配修復缺陷（different mismatch repair，dMMR）導致的，還有一些結直腸癌與PIK3CA基因突變、HER2擴增和NTRK基因融合等有關[2]。美國國立綜合癌癥網絡（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）發布的結直腸癌診療專家共識明確指出，對實施抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向治療的轉移性結直腸癌患者需明確BRAF、KRAS和NRAS基因的突變狀態[3]。

傳統的組織活檢存在創傷性，且取材范圍受限，無法實時反映腫瘤的變化；而液體活檢作為一種便捷、非侵入性的檢測方法，可多次取材、實時反映腫瘤異質性的變化，為腫瘤的個性化診療提供參考依據，在結直腸癌早期診斷、預后判斷、復發監測、化療和靶向治療等方面均有較好的臨床價值[4]。腫瘤患者體內循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）除正常細胞來源外，還有凋亡腫瘤細胞釋放到血液中的DNA小片段，即循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。ctDNA的基因組譜與相應腫瘤的基因組譜匹配率較高，對分子病理學和臨床腫瘤學均有重要意義[5]。由于體細胞突變只存在于腫瘤細胞DNA，而這些DNA是特異的可被檢測和追蹤的生物標志物，其臨床價值優于臨床常用的癌胚抗原、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等蛋白標志物[6]。隨著下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術的發展，通過檢測cfDNA指導腫瘤的臨床診療變得更加切實可行。根據我國《醫療器械監督管理條例》[7]的規定：對于國內尚無同品種產品上市的體外診斷試劑，符合條件的醫療機構根據本單位的臨床需求，可以自行研制，在執業醫師指導下在本單位內使用。目前尚無用于cfDNA檢測的商品化試劑盒，因此本研究擬基于NGS平臺建立檢測結直腸癌患者cfDNA的方法，并根據《我國醫學檢驗部門自建檢測方法發展與管理建議》[8]和《實驗室自建分子診斷項目基本要求專家共識》[9]中的試劑盒性能評價要求進行臨床應用評估。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年8月—2019年12月復旦大學附屬中山醫院經病理學檢查確診的晚期結直腸癌患者39例，其中男22例、女17例，年齡31～78歲；39例患者中有22例為初診未治患者，收集這22例患者采用突變擴增阻滯系統（amplification refractory mutation system，ARMS）檢測腫瘤組織中靶向藥物相關基因突變的結果。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Ion Chef instrument系統、Ion S5 XL高通量測序儀、Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR儀、ABI 7500 PCR儀均購自美國ThermoFisher Scientific公司。2100生物分析儀購自美國Agilent公司。Qubit熒光定量儀購自美國Invitrogen公司。Agencourt核酸純化試劑盒購自美國貝克曼庫爾特公司。0.2 mL PCR管式磁分離架購自美國Permagen Labware公司。

1.2.2 商品化參考品 野生型和預期突變位點為PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、KRASG12D、BRAFV600E、MAP2K1 Q56P、NRASQ61K、CTNNB1 S33Y，突變頻率為0.1%、0.2%、0.5%的商品化參考品（貨號為HD817）購自英國Horizon Discovery公司。野生型和預期突變位點為PIK3CAH1047R、NRASQ61R、KRASQ61H、KRASG12D、BRAFV600E、ERBB2 A771_Y772insYVMA、AKT1 E17K，突變頻率為0.1%、0.2%、0.5%的商品化參考品（貨號分別為0710-0672、0710-0673、0710-0674）購自美國SeraCare公司。

1.2.3 自制參考品EPS3 根據結直腸癌患者血漿cfDNA檢測系統（簡稱結直腸癌cfDNA panel）所覆蓋的位點，將結直腸癌及肺癌細胞系（商品化人結腸癌細胞HT-29、人非小細胞肺癌細胞NCI-H1650、人肺腺癌細胞NCI-H1975、人結腸癌細胞HCT-116、人結直腸腺癌細胞HCT-15）DNA和人源基因組DNA打斷至平均片段長度為170 bp，用表觀健康者來源的基因組DNA（野生型）稀釋至期望突變頻率為0.1%、0.2%和0.5%。自制參考品EPS3覆蓋的預期突變分別為PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、KRASG13D、BRAFV600E。

1.2.4 其他試劑 MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit、Oncomine Colon cfDNA Assay、Ion Library TaqMan Quantitation Kit、Ion 540 Kit-Chef芯片、Ion 540 Chip Kit均購自美國ThermoFisher Scientific公司。Qubit dsDNA HS assay購自美國Invitrogen公司。High Sensitivity DNA Kit購自美國Agilent公司。QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit購自德國QIAGEN公司。比對方法中通用文庫構建試劑盒和核酸純化試劑盒均購自上海安可濟生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的采集、處理和檢測 采用Vacutainer采血管（美國BD公司）采集所有患者靜脈血20 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。1 581×g離心10 min，分離血漿，置于2 mL Eppendorf管中，然后再以16 873×g離心10 min，獲得乏細胞血漿，吸出血漿，置于新的2 mL Eppendorf管中，-80 ℃保存待檢。基于NGS平臺構建結直腸癌cfDNA panel，由MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit、Ion Library TaqMan Quantitation Kit、Ion 540 Kit-Chef芯片、Ion S5 XL高通量測序儀和Oncomine Colon cfDNA Assay組成。采用MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit抽提血漿中的cfDNA，并采用Qubit dsDNA HS assay進行cfDNA定量，總量≥10 ng，片段分布主峰約為170 bp，且無明顯的基因組污染（無或僅有少量>2 000 bp的片段）。使用Ion Library TaqMan Quantitation Kit構建抽提后的cfDNA文庫，根據實時熒光定量PCR的濃度結果計算文庫稀釋比例，確保文庫混合后總體積>25 μL，終文庫總量>100 pmol/L。取稀釋后的子文庫等體積混合，加載于Ion 540 Kit-Chef芯片并測序。采用Torrent Suite Software 5.10.0軟件和Ion Reporter Software 5.10.1.0軟件（美國ThermoFisher Scientific公司）對測序數據進行生物信息學分析，對實驗操作、樣本測序數據和變異位點數據進行質量控制，同時對結果作出解釋。

1.3.2 Miseq Dx二代測序平臺 比對方法為Miseq Dx二代測序平臺，由Fire fly建庫策略（上海安可濟生物科技有限公司）和Illumina二代測序平臺（美國Illumina公司）構成。采用NGS檢測4個經NCCN指南批準的與結直腸癌相關的基因（KRAS的2、3和4號外顯子，NRAS的2、3號外顯子，BRAF的15號外顯子，PIK3CA的9、20號外顯子）。

1.4 方法學評價

1.4.1 準確性 采用結直腸癌cfDNA panel檢測12份不同配比的商品化參考品和自制參考品，統計各參考品的突變位點及其檢出次數，并與預期結果比較，計算準確度。可接受標準：最終用于計算的樣本須通過文庫和測序質量控制標準，與預期結果比較，準確度應≥90%。

1.4.2 精確性 取突變頻率為1.0%的自制參考品EPS3，檢測PIK3CAE545K、KRASG13D、TP53 S241F、BRAFV600E、TP53 R273H和PIK3CAH1047R。（1）批內精密度：在同一次試驗中重復檢測3次，計算均值（x）、中位數（M）、標準差（s）和變異系數（coefficient of variation，CV）。（2）批間精密度：連續檢測3 d，每次重復檢測3次，計算x、M、s和CV。（3）重復性：分別由2位檢測人員進行檢測，重復檢測18次。（4）可接受標準：將cfDNA用Qubit dsDNA HS assay進行定量檢測，同一操作者批內定量結果的CV<20%，批間定量結果的CV<40%，cfDNA的提取回收率>30%。最終用于計算的樣本須通過文庫和測序質量控制標準，變異陽性符合率和陰性符合率應均為100%。

1.4.3 參考區間 結直腸癌相關體細胞基因突變參考區間為“未檢測到突變”。

1.4.4 可報告范圍 對于NGS可測定的基因區域，結直腸癌cfDNA panel共覆蓋14個基因（AKT1、ERBB2、NRAS、APC、FBXW7、PIK3CA、BRAF、GNAS、SMAD4、CTNNB1、KRAS、TP53、EGFR、MAP2K1）的242個熱點變異位點，主要為單堿基突變和插入缺失標記。

1.4.5 用于抽提的最少樣本量 對1和2 mL起始量的血漿進行提取，每份起始血漿樣本批內重復提取3次，并與4 mL起始量的血漿比較。可接受標準：采用Qubit定量檢測提取后得到的cfDNA，從1、2、4 mL血漿樣本中提取的cfDNA量應大致成比例增加，且cfDNA的回收率>30%。

1.4.6 cfDNA的最低檢測量 取正常人血漿樣本，分別加入10、20和50 ng的自制參考品EPS3（突變頻率為0.5%），檢測PIK3CAE545K、KRASG13D、TP53 S241F、BRAFV600E、TP53 R273H和PIK3CAH1047R突變，每份樣本重復檢測3次。可接受標準：最終用于計算的樣本須通過文庫和測序質量控制標準，變異陽性符合率應為100%，cfDNA最低檢測量應在通過驗證的最低值和最高值之間。

1.4.7 分析靈敏度 在分子檢測領域，分析靈敏度是指用該分子檢測技術能夠測到生物樣本中待測靶核酸分子的最低含量。對突變頻率為0.2%的自制參考品EPS3重復檢測20次。根據本平臺建議的最低檢測量為20 ng cfDNA，中位測序深度≥7 500×。可接受標準：最終用于計算的樣本須通過文庫和測序質量控制標準，陽性檢出率應≥95%。

1.4.8 分析特異性 在2份野生型和2份突變型（預期突變為BRAFV600E，經過微滴式數字PCR驗證）血漿（4 mL）中分別加入10 000 mg/L血紅蛋白（美國Sigma-Aldrich公司，批號SLBR9638V）、500 mg/L膽紅素（美國Sigma-Aldrich公司，批號SLBX1739）或2%脂肪乳（四川科倫藥業股份有限公司，批號F17060801）。采用MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit進行抽提，檢測BRAFV600E突變。比較干擾物加入前后的檢測結果。

1.5 臨床應用評估

分別采用結直腸癌cfDNA panel和Miseq Dx二代測序平臺檢測17例晚期結直腸癌患者血漿中靶向藥物相關基因（AKT1、ERBB2、NRAS、APC、FBXW7、PIK3CA、BRAF、GNAS、SMAD4、CTNNB1、KRAS、TP53、EGFR、MAP2K1）的突變豐度，比較2種檢測系統結果的一致性。采用結直腸癌cfDNA panel檢測22例初診未治結直腸癌患者血漿中靶向藥物相關基因的突變豐度，并與ARMS檢測結果進行比較。ARMS與本平臺共同覆蓋的位點為：KRAS的2、3、4號外顯子，NRAS的2、3號外顯子，PIK3CA的20號外顯子、BRAF的15號外顯子。

2 結果

2.1 方法學評估結果

2.1.1 準確性 采用結直腸癌cfDNA panel檢測商品化參考品和自制參考品EPS3，并與預期結果進行比較，準確性為99.97%，Kappa值為0.99。見表1。

表1 準確性試驗結果 次

2.1.2 精確性 抽提精確性符合要求，且抽提所得樣本通過文庫和測序質量控制標準，重復檢測18次，對預期突變的檢出率均為100%。精確性符合要求。見表2。

表2 精確性結果

2.1.3 用于抽提的最少樣本量 對1、2和4 mL血漿進行提取的總回收率分別為46.00%、45.90%和52.28%，且cfDNA的回收率均>30%，結果均能滿足要求。因此，最小樣本量為1 mL血漿。

2.1.4 cfDNA投入量 重復檢測3次突變頻率為0.5%的10 ng自制參考品EPS3，已知突變均可正確檢出。故最低檢測量為10 ng cfDNA。

2.1.5 分析靈敏度 采用結直腸癌cfDNA panel對突變頻率為0.2%的自制參考品EPS3重復檢測20次，6個基因突變位點（BRAFV600E、KRASG13D、PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、TP53 R273H、TP53 S241F）的陽性檢出率為100%，故分析靈敏度為0.2%。由于本實驗室經過性能確認的NGS檢測平臺的分析靈敏度均為0.2%，因此考慮到NGS的檢測性能，同時也為保持報告的一致性，本研究僅驗證突變頻率為0.2%的自制參考品EPS3。

2.1.6 分析特異性 2份野生型血漿樣本和2份突變型血漿樣本在干擾物加入前、后的突變檢出結果一致，定性結果一致率為100%。提示10 000 mg/L血紅蛋白、500 mg/L膽紅素或2%脂肪乳對結直腸癌cfDNA panel檢測cfDNA無影響。見表3。

表3 分析特異性結果

2.2 臨床應用評估

結直腸癌cfDNA panel與Miseq Dx 二代測序平臺共同覆蓋的基因為KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA。采用2種檢測系統測定17例晚期結直腸癌患者血漿中靶向藥物相關基因的突變豐度，其中有16例患者2種檢測系統的檢測結果在共同覆蓋基因位點上一致，有1例患者的檢出結果雖一致，但結直腸癌cfDNA panel的檢測結果低于既定的檢測下限，故2種方法的一致性為94.12%（16/17），滿足臨床檢測的需求。其中檢出最多的突變位點為KRAS的2號外顯子，17例患者中出現了6例。見圖1。

圖1 結直腸癌cfDNA panel與Miseq Dx二代測序平臺的一致性

結直腸癌cfDNA panel檢測22例結直腸癌患者血漿中靶向藥物相關基因突變豐度與ARMS檢測腫瘤組織的一致性為90.91%（20/22）。突變位點出現最多的基因為TP53、APC和KRAS，占總突變的62.22%。見圖2。

圖2 結直腸癌cfDNA panel與ARMS的一致性

3 討論

NCCN 2009年發布的結直腸癌診治指南推薦檢測晚期結直腸癌患者KRAS基因[10]；2010年發布的結直腸癌診治指南建議對KRAS基因野生型患者進一步檢測BRAF基因V600E突變來預測患者是否可以從抗EGFR單克隆抗體治療中獲益[10]；2018年發布的結直腸癌診治指南建議，對所有伴有轉移性結直腸癌患者進行KRAS、NRAS、BRAF基因檢測，以指導用藥[11]。2019.V1版的NCCN結直腸癌診治指南新增BRAF基因作為指導治療的指標和基于檢測EGFR的治療方法[12]。在結直腸癌患者中，NRAS基因總突變率約為3.9%[13]，因此NRAS基因的突變狀態對于結直腸癌患者靶向藥物治療的選擇同樣具有重要意義[14]。與結直腸癌密切相關的經典的原癌基因有BRAF、C-myc、PIK3CA、KRAS、NRAS、c-fos、c-jun、c-raf、src、abl、fps等[15]。與結直腸癌密切相關的經典的抑癌基因有APC、DCC、p53、PTEN、Rb、RUNX3、NDRG2、p16、DPC4、KLF6等[16]。

NCCN發布的結直腸癌診治指南強調了NGS對于結直腸癌相關突變基因聯合檢測的應用價值，還有研究指出NGS在圍手術期ctDNA動態監測中的價值[17]。由此可見，NGS在結直腸癌臨床診療中可以為患者提供更加完善的個體化診療方案。

對比兩組患兒治療的臨床療效，評判標準[2] ：顯效，患兒經過相關治療后，臨床癥狀呼吸困難、咳嗽、喉鳴等顯著改善；有效，患兒經過相關治療后，臨床癥狀呼吸困難、咳嗽、喉鳴等有一定改善，但未完全改善；無效，患兒經過相關治療后，臨床癥狀呼吸困難、咳嗽、喉鳴等沒有任何好轉跡象，甚至加重；總有效率=顯效率+有效率。

與有商品化試劑的檢測項目不同，實驗室自建項目在應用于臨床前需要進行更加嚴謹的性能確認，包括開展項目的應用目的、樣本類型、采集和運送樣本的程序、樣本拒收標準、臨床應用指征以及方法的準確性、精確性、分析靈敏度和抗干擾能力等。本研究主要對結直腸癌cfDNA panel檢測結直腸癌相關基因突變的定性試驗的各項性能指標進行了評估。

對于定性分析來說，準確性是指與比對試驗或標準方法檢測結果的相關性。本研究結果顯示，采用自建的結直腸癌cfDNA panel檢測商品化參考品和自制參考品EPS3的Kappa值為0.99，表明自建平臺準確性極高；檢出3個假陰性結果，分別出現在貨號為HD817（突變頻率為0.2%）和貨號為0710-0672（突變頻率為0.2%）的商品化參考品中，其中有2個假陰性結果（未測得KRAS和PIK3CA突變）出現于同一個商品化參考品（貨號0710-0672）中，其余1個假陰性結果是在商品化參考品（貨號HD817）中檢出KRAS突變。由于這2個商品化參考品的突變頻率較低時可能會出現結果不穩定的情況，因此結直腸癌cfDNA panel的檢測結果接近分析靈敏度時，應考慮使用更加靈敏的數字PCR進行復核。

與臨床常用的BEAMing等結直腸癌相關基因檢測技術相比，本研究使用的結直腸癌cfDNA panel可在短時間內完成對上百億堿基的測序[18]，同時保持了高準確性。本研究結果顯示，結直腸癌cfDNA panel的分析靈敏度為0.2%，而具有相同分析靈敏度的高分辨率熔解曲線只能測定已知突變，且成本較高[19]。

本研究結果顯示，500 mg/L膽紅素和2%脂肪乳對結直腸癌cfDNA panel檢測cfDNA均無干擾，雖然加入10 000 mg/L血紅蛋白后血漿樣本的抽提不受干擾，但樣本溶血后會導致基因組DNA被釋放入血，對于腫瘤細胞等體細胞突變陽性結果的檢出有一定影響[20]，因此樣本出現溶血時建議重新采血進行檢測。

由于不同NGS平臺的檢測原理不同，常會導致結果差異較大，因此本研究將結直腸癌cfDNA panel與Miseq Dx二代測序平臺的檢測結果進行比較，結果顯示，17例晚期結直腸癌患者中有16例2種檢測系統的檢測結果一致，有1例雖檢出相同的突變，但由于結直腸癌cfDNA panel檢測結果低于分析靈敏度而被排除，可能與該例樣本突變頻率較低，經過凍存后突變頻率進一步降低有關。因此，當結直腸癌cfDNA panel的檢測結果低于檢出下限時，可以采用數字PCR進行復核。

高潔等[21]等采用靶向NGS平臺Ion Torrent PGM檢測甲醛固定石蠟包埋結直腸癌組織標本KRAS2號外顯子及擴展RAS突變，并與Sanger測序和ARMS比對，結果顯示Ion Torrent PGM平臺與Sanger測序、ARMS的一致性為100%。提示NGS平臺在檢測靶向藥物相關基因突變時具有較好的檢測性能。本研究結果顯示，結直腸癌cfDNA panel與ARMS的一致性為90.91%，其中有2例不符合，該2例樣本均為化療后采樣，腫瘤負荷和突變位點可能因化療而發生了變化。與ARMS相比，結直腸癌cfDNA panel投入量更小，可同時檢測多種突變，并可依據檢測結果對治療方案作出實時調整。

Miseq Dx二代測序平臺有橋式累計錯誤、熒光信號干擾等不足[22]，而本研究使用的NGS平臺具有測序速度快、通量大、后續數據處理簡潔等優勢，且靈敏度和特異性均較好，因此適用于臨床常規檢測。此外，運用NGS檢測基因突變可節省樣本與時間，性價比高，在結直腸癌相關基因突變檢測方面具有重要的臨床應用前景。

有研究結果顯示，組織樣本與胸腔積液、腹腔積液樣本的基因突變檢出率相當，且均高于血漿cfDNA的突變檢測率[23]。但本研究結果顯示，在22例初診結直腸癌患者的血漿樣本與組織樣本檢測結果的比對中，除組織ARMS檢測未能覆蓋到的基因位點變異外，其他基因突變檢測結果均一致。提示檢測血漿cfDNA可以滿足臨床需求。

本研究采用結直腸癌cfDNA panel檢測結直腸患者血漿cfDNA，不僅可以作為組織樣本檢測的補充驗證或實時監測患者的療效及耐藥性變化，同時還可作為結直腸癌患者的初步篩查指標。對于結直腸癌患者來說，結直腸癌cfDNA panel可以進行KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因聯合檢測，為臨床個體化靶向藥物治療提供更準確的理論依據。由于受到患者匹配度和檢測成本的限制，本研究用于驗證的患者樣本數有限，后續將收集更多患者樣本進一步驗證。

綜上所述，結直腸癌cfDNA panel作為實驗室自建項目，具有高準確性、高特異性等優勢，有助于結直腸癌患者的個體化診療，具有廣闊的臨床應用前景。但由于我國目前尚無針對NGS咨詢的原則和操作規范，因此檢出基因突變后，如何向臨床醫生或患者進行基因變異的解釋是臨床實驗室面臨的難題，這需要在未來的實踐和研究中不斷總結。