TGF-β3對成骨細胞的增殖和成骨能力的影響及其機制初探

艾力麥爾旦·艾尼瓦爾，木合塔爾·霍加，王 玲

創傷、腫瘤、炎癥以及牙源性疾病引起的各類頜面部骨缺損嚴重影響患者的咬合、咀嚼功能和美觀[1]。各類頜骨缺損的修復重建是臨床難題。自體骨移植是目前被廣泛接受的修復頜面部骨缺損的首選治療方法，但其缺點如供區骨量不足、供區骨形態與受區不符、免疫排斥、創傷大等限制其應用和療效。骨替代品如同種異體骨、異種異體骨和人工合成骨等雖然也是不錯的選擇，但也存在免疫排異、吸收率高、價格貴等缺點，從而影響其廣泛應用[2]。所以近年來學者們嘗試從組織工程的角度尋找通過自身骨組織再生來修復各類骨缺損的方案，其中各類生長因子和支架材料的聯合應用下誘導有成骨分化能力的各類細胞使其加速成骨是近階段主要的研究方向[3]。顱蓋骨來源的成骨細胞與頜面部諸骨均來自于間充質細胞的增殖和分化，兩者具有相同的胚胎發育起源，而且顱蓋骨來源的成骨細胞易于獲取和培養[4]，是動物實驗時研究頜面部骨組織再生比較理想的細胞。

轉化生長因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)是一類多效能生長因子，參與調控細胞的生物化學信息傳遞、增殖分化和凋亡過程[5]。TGF-β3在造血和免疫干細胞、癌細胞的功能調節方面發揮重要作用。TGF-β3介導的細胞信號傳導多數是TGF-β與細胞膜上的Smad蛋白結合來實現，即經典的TGF-β-Smad依賴通路。課題組前期研究已用改良酶消化法和酶解組織塊法成功分離培養兔顱蓋骨來源的成骨細胞和牙髓干細胞并證實TGF-β3能夠促進牙髓干細胞的增殖和成骨能力，其成骨誘導作用有TGF-β-Smad依賴通路的參與[4,6-7]，而TGF-β3對成骨細胞的增殖和成骨影響至今相關報道甚少。本研究在前期研究的基礎上，選取0.1～100 μg/L濃度的TGF-β3加入成骨細胞培養液中誘導培養，觀察TGF-β3對成骨細胞的增殖和成骨能力的作用及其初步機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗動物 清潔級新西蘭大白兔幼兔3只，1周齡，體重80～100 g，雌雄不限，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。使用許可證編號：SYXK(新)2015-0001；生產許可證號：SCXK(新)2015-0004。動物的使用通過新疆醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準(動物倫理審批號:IACUC-20190218-007)。

1.1.2 實驗試劑與儀器 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶、高糖DMEM培養基 (Hyclone，美國)，TGF-β3(Peprotech，美國)，ALP活性測定試劑盒(南京建成公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)，二甲基亞砜(DMSO)(Amresco，美國)，OCN一抗(Abcam，美國)，COL-1A1一抗(Novus Biologicals，美國)，Runx-2一抗(北京博奧森公司)二氨基聯苯胺染色試劑盒(DAB)(北京中衫金橋公司)，小鼠單抗β-actin、兔多抗Smad2/3(武漢博士德公司)定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，5%CO2恒溫孵箱、離心機、酶標儀(Thermo，美國)，倒置顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞的培養與純化 參照本課題組前期方法[4]，處死新西蘭幼兔取出顱蓋骨剔除表面的軟組織后切成1 mm×1 mm×1 mm大小骨小塊，2.5 g/L胰蛋白酶中預消化20 min，1 g/LⅠ型膠原酶在恒溫搖晃器中搖晃40 min，終止消化后將懸液用200目細胞篩網過濾，將未通過篩網的組織塊分離出來PBS沖洗后放入培養瓶中，加入完全培養液放入細胞培養箱中培養，每2～3 d換液1次，待細胞長滿80%～90%后用差速貼壁法[4]純化以得到高純度的成骨細胞，純化后的細胞每48 h換液1次，待細胞長滿培養瓶80%～90%后傳代。每次換液時顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照。

1.2.2 成骨細胞的鑒定 分離培養并純化的成骨細胞行形態學觀察，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測，免疫細胞化學染色觀察膠原蛋白-1A1(collagen-1a1, COL-1A1)，Runt相關骨形成蛋白-2(runt-related transcription factor-2, Runx-2)以及骨鈣素(osteocalcin, OCN)的表達情況，采用qPCR法行成骨標志基因ALP，骨橋蛋白(osteopontin, OPN),骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)，成骨細胞特異性轉錄因子(Osterix, Osx)檢測，培養3周后茜素紅染色觀察成骨細胞形成的礦化結節。

1.2.3 茜素紅染色 第3代成骨細胞常規培養21 d棄培養液，用質量濃度為4%的多聚甲醛固定40 min，棄固定液，PBS沖洗3次后加入1 mL質量濃度為1%的茜素紅染液，37 ℃放置40 min后PBS沖洗染液，移置超凈臺內自然干燥后顯微鏡觀察各組礦化結節形成情況并拍照。

1.2.4 實驗分組 成骨細胞分為對照組和實驗組，對照組為常規培養液(10%FBS+1%雙抗的DMEM高糖培養液)培養的成骨細胞。實驗組分4組，分別為在對照組培養液中加入0.1、1、10、100 μg/L濃度的TGF-β3。

1.2.5 CCK-8法測定細胞增殖 第3代成骨細胞以5×103個/孔接種于7塊96孔板中，每板細胞分為5組，每組設4個復孔(其中1孔為空白對照)，各組分別培養1、3、5、7、9、11、13 d后各取一塊培養板棄培養液，根據CCK-8試劑盒操作步驟操作并在450 nm處測定各孔吸光度值，每組重復測3次并計算各組平均值，以培養天數為橫軸，吸光度平均值為縱軸做生長曲線圖。

1.2.6 ALP含量測定 第3代成骨細胞以1×104個/孔濃度接種到24孔板中，每組設3個復孔，分別培養7、14 d后按照ALP試劑盒操作步驟操作，酶標儀490 nm處檢測各組細胞吸光度值，每組重復測3次取平均值并計算各組ALP含量(金氏單位)。

1.2.7 免疫細胞化學染色 第3代成骨細胞以1×104個/孔細胞濃度接種于4塊24孔板中，每板設5組，分別在分組培養第1、3、5、7天取一塊培養板棄液，4%多聚甲醛固定1 h，PBS洗3次，進口羊血清封閉40 min后滴加以合適比例稀釋的鼠抗兔OCN、COL1-A1和Runx-2一抗，根據抗體說明書操作步驟操作，最后DAB顯色，蘇木素復染，鏡下觀察染色情況并拍照，每組實驗重復3次。染色后胞質棕染判定為陽性。陽性判定具體方法參照課題組前期實驗方法[4]，各組細胞顯微鏡( ×100)下隨機取中段5個視野，用cellSens Dimension 軟件分析每個視野中陽性面積所占比例，陽性率為20%以下則判定為陰性，陽性率30%～50%為弱陽性，陽性率50%～80%為陽性，陽性率>80%則判定為強陽性。

1.2.8 實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR) 第3代成骨細胞以1×106個/孔接種于2塊6孔板中，隨機分為5組培養，培養7、14 d后，每組細胞用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，逆轉錄反應條件如下。25 ℃:5 min，50 ℃:15 min，85 ℃:5 min，4 ℃:10 min，將β-actin作為內參對照。逆轉錄后的RNA用實時熒光定量PCR測定各組細胞ALP、OPN、BSP、Osx和Smad4基因的表達量，PCR反應條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s，60 ℃，30 s,40個循環，根據結果繪制溶解曲線，數據用2-ΔΔCt進行分析，用GraphPad Prism 7.0軟件進行繪圖。引物設計合成：廣州天一輝遠公司(表1)。

表1 本研究中PCR基因引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.9 Western blotting檢測 細胞接種和分組方法同上，分組培養7 d后先用全蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒定量并測定蛋白濃度，加熱變性后冷卻至室溫，放入-20 ℃保存。各組取20 μg蛋白進行凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，加入封閉液封閉2 h，滴加Smad2/3一抗(稀釋比例1∶500) 4 ℃孵育過夜，洗去一抗后加入用封閉液稀釋(稀釋比例1∶50 000)的二抗將PVDF膜浸泡于二抗孵育液中室溫搖床孵育2 h，洗去二抗TBST洗滌PVDF膜，滴加ECL工作液，待熒光帶明顯后覆保鮮膜，膠片壓片后依次放入顯影液、定影液，沖洗晾干后掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.3 統計學處理方法

2 結 果

2.1 細胞鑒定結果

2.1.1 細胞形態學觀察結果 組織周圍48 h即可觀察到爬出的成骨細胞(圖1A)，貼壁生長，約8～11 d后細胞長滿培養瓶80%～90%。差速貼壁法純化和傳代后的細胞形態趨于單一呈三角形或多角形,細胞形態特征符合典型的成骨細胞形態(圖1B)。

A：貼壁培養48 h后可見組織塊兒周圍爬出的成骨細胞( ×50)；B：第3代成骨細胞( ×100)；C：成骨細胞培養21 d后茜素紅染色可見礦化結節( ×50)

2.1.2 成骨細胞標志物檢測結果 成骨細胞的表面標志物ALP(表2)，COL-1A1、Runx-2和OCN蛋白(圖2)和OPN、BSP(圖3)均有明顯的表達，成骨細胞常規培養后細胞外基質內形成礦化結節(圖1C)。以上結果均表明所分離培養的細胞為成骨細胞。

表2 各組細胞ALP活性(金氏單位)Tab.2 ALP activity of each group

2.2 CCK-8測定結果

成骨細胞在對數增長期1～100 μg/L TGF-β3能明顯促進細胞增殖(P<0.05)，10 μg/L TGF-β3組細胞活性在細胞對數增長期過后的平臺期仍高于對照組(P<0.05)(圖4)。

A、D、G：對照組第一天(陰性對照)；B、E：對照組第3天；C、F:10 μg/L TGF-β3組第3天；H：對照組第5天；I:10 μg/L TGF-β3組第5天

圖4 各組細胞生長曲線Fig.4 Growth curve of cells in each group

2.3 ALP活性測定結果

10 μg/L TGF-β3組ALP測定值始終較對照組高(P<0.05)，100 μg/L TGF-β3組ALP表達第6天后高于對照組，其余組ALP含量與對照組無統計學差異(P>0.05)(表2)。

2.4 免疫細胞化學染色結果

COL-1A1染色對照組第3天出現弱陽性而10、100 μg/L TGF-β3組則均出現強陽性；Runx-2染色對照組第3天弱陽性、第5天強陽性，10、100 μg/L TGF-β3組第3天即出現強陽性；對照組OCN染色第5天出現弱陽性第7天陽性，10、100 μg/L TGF-β3組第3天出現弱陽性，第5天即出現強陽性(圖2)。

2.5 qPCR結果

10 μg/L、100 μg/L TGF-β3組在第7、14天時ALP、OPN、BSP基因的表達含量均較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)；10 μg/L TGF-β3組第7天時ALP、OPN、Osx表達量明顯高于對照組(P<0.01);10 μg/L TGF-β3組Smad4基因表達在第7、14天時均較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)，100 μg/L TGF-β3組Smad4基因則僅在第7天較對照組高(P<0.05)(圖3)。

各組計量資料采用ANOVA 分析，組間多重比較采用LSD，與對照組比較，a： P<0.05，b： P<0.01

2.6 Western blotting結果

1、10 、100 μg/L TGF-β3組Smad2/3蛋白的表達量高于對照組(P<0.05)，其中10 μg/L TGF-β3組Smad2/3蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.01)(圖5)。

3 討 論

TGF-β3是TGF-β家族的一個亞型，其在組織創傷修復、軟骨愈合、瘢痕修復、纖維組織形成等方面發揮重要調控作用，其相關研究也較成熟[8-9]。近年來隨著生物支架材料的不斷更新換代，TGF-β3在生物支架材料的支撐下促進和誘導間充質來源的成體干細胞的增殖和成骨、軟骨向分化方面的研究愈來愈深入[10-12]，特別是在成骨的早期階段其作用比較顯著[13-14]，但TGF-β3的最佳誘導濃度存在較大的分歧。TGF-β3誘導牙周膜干細胞成骨分化最佳濃度為500 μg/L[15]，作用于骨髓間充質干細胞向成骨誘導最佳濃度為25 μg/L[16]，而誘導牙髓干細胞成骨向分化的最佳作用濃度為80 μg/L[6-7]。TGF-β3對細胞的增殖和分化的誘導效果隨TGF-β3濃度和誘導時間發生變化，有研究發現TGF-β3的成骨誘導作用在成骨早期比較明顯。本研究選取0.1～100 μg/L濃度的TGF-β3創新探索其對成骨細胞的細胞增殖和礦化作用的影響，結果顯示TGF-β3對成骨細胞增殖和成骨能力較優誘導濃度范圍為10～100 μg/L。

與對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01

TGF-β3對顱蓋骨來源的純成骨細胞的增殖和礦化能力國內外至今未見相關報道，而其在各類藥物和毒素作用下增殖能力發生變化的研究較多。有研究發現同樣是TGF-β家族成員的BMP-2能促進小鼠顱骨來源成骨細胞的增殖能力[17]。李若涵等[18]報道25 μg/L濃度的肝細胞生長因子(HGF)對小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞的增殖有顯著促進作用。有研究證實1 μg/L濃度的TGF-β對小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞的增殖作用最顯著[19]，但此研究并未闡明具體是TGF-β的哪個亞型。本研究發現10 μg/L濃度的TGF-β3增殖能力較其余組強，此作用在成骨細胞對數增長期尤為明顯。

ALP是成骨細胞典型標志酶，成骨細胞成骨早期即在細胞基質內分泌豐富的ALP，本實驗結果顯示10 μg/L濃度的TGF-β3組ALP表達活性始終明顯高于對照組，100 μg/L TGF-β3組ALP表達第6天后高于對照組，qPCR結果也發現10～100 μg/L濃度范圍的TGF-β3組ALP基因表達含量始終高于對照組。COL-1A1也是成骨細胞重要的特異性蛋白。Runx-2在成骨分化早期活躍表達，其下游基因是Osx和OPN，而OCN和BSP則在成骨晚期表達明顯[20]。本研究免疫細胞化學染色結果顯示10 μg/L的TGF-β3能夠加速成骨細胞的COL-1A1、Runx-2和OCN蛋白的表達時間，qPCR結果也顯示在10～100 μg/L濃度范圍內TGF-β3組OPN、BSP、Osx基因的表達含量均高于對照組，說明10～100 μg/L濃度范圍的TGF-β3均能縮短成骨細胞成骨所需的時間，10 μg/L的TGF-β3對成骨細胞成骨作用較100 μg/L組顯著。

TGF-β3對細胞的作用是通過與細胞膜的特異性受體結合來實現。大部分細胞表面都有TGF-β受體，目前發現的TGF-β受體有三種，即TGF-β受體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(T-βRⅠ、T-βRⅡ和T-βRⅢ)[5,21]。TGF-β信號通路包括TGF-β-Smad依賴(典型路徑)和TGF-β-Smad不依賴的通路。Smad蛋白是參與TGF-β信號傳導的一類蛋白，目前哺乳動物體內發現有8個Smad，即Smad1～Smad8(Smad9又被稱為Smad8)[5,22]。TGF-β-Smad不依賴的通路包括ERK、JNK、p-p38介導的MAPK通路和PI3K/Akt信號通路[23]。TGF-β-Smad依賴的通路作用機制是受體信號開始時TGF-β3首先結合到細胞膜上的T-βRⅡ，然后招募和激活T-βRⅠ并磷酸化，隨后被T-βRⅠ磷酸化的TGF-β3與細胞核內的Smad2和Smad3蛋白結合并與Smad4結合形成聚合物并轉導信號從而完成目的基因的表達[21-22,24]。TGF-β-Smad不依賴的信號傳導過程沒有Smad蛋白的參與和表達。Smad家族中與細胞成骨相關的是Smad1、5、9，但不管與成骨相關與否，以上Smad都需要磷酸化后與Smad4結合形成聚合物并進入到細胞核內以后才能完成目的基因的轉錄和表達[22-25]，所以Smad4和其前體Smad2、3是在TGF-β-Smad依賴通路的激活和轉錄過程中發揮重要作用的Smad蛋白。Smad2和Smad3因其分子生物學組成結構和作用非常相似，多數研究以Smad2/3復合物的形式進行檢測和描述[25]。本實驗結果顯示10 μg/L的TGF-β3誘導成骨細胞后Smad4基因以及Smad4的前體Smad2/3蛋白的表達量均高于對照組，提示TGF-β3誘導的成骨細胞促成骨作用有TGF-β-Smad依賴通路的激活，而其上游的Smad1、5、9等是否參與到TGF-β3誘導的成骨過程需要后期實驗進一步探索。TGF-β3誘導的促成骨過程中TGF-β-Smad依賴通路的激活和具體作用需要后期進行信號通路阻斷實驗來進一步驗證。

綜上所述，TGF-β3在10～100 μg/L濃度范圍內對成骨細胞的增殖和成骨具有一定的促進作用，其中10 μg/L的TGF-β3成骨促進效果最明顯，其促成骨作用可能通過TGF-β-Smad依賴的通路實現的。本研究為利用生長因子促進成骨并將其運用到臨床骨組織缺損的修復治療提供了一定的理論依據。