牙髓血運重建術后根管內礦化組織形成的研究進展

高碧聰，呂柯佳 ，沈晨露，葉偉佳 ，胡 文，姚 華

年輕恒牙是指剛萌出到口腔，形態、結構尚未完全成熟的恒牙。年輕恒牙在發育過程中常因齲病或外傷等因素導致牙髓感染或壞死，進而出現根尖發育停止的現象。喇叭口樣寬大的根尖若用常規根管治療的方式直接充填，易引發超充、充填不密、根折等問題。牙髓血運重建術(dental pulp revascularization)多以血凝塊為支架，誘導年輕恒牙的殘余牙髓細胞、根尖周干細胞在根管壁表面形成礦化組織，起到增厚根管壁、封閉根尖孔的作用。早在上個世紀60年代，就有學者提出利用根管內血凝塊修復根管組織的策略[1]。2001年，Iwaya等首次提出牙髓血運重建術這一概念，通過滅菌藥物灌洗代替機械清潔根管，保留年輕恒牙根尖存活牙髓以促進根管內組織再生[2]。2004年，Banchs等正式制定牙髓血運重建技術操作流程[3]，后人不斷對其加以修改與完善，2013年美國牙髓病協會(American Association of Endodontics，AAE)發布了完整的牙髓血運重建術的操作指南。

早期的臨床研究通過X線片驗證了牙髓血運重建術后部分患牙可出現牙根增長、根管壁增厚的現象。最初，學者們推測根管內新形成的硬組織來源于根尖區殘留的未感染牙髓組織[2]，Herwig′s上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath, HERS)細胞和根尖周干細胞也可能與牙髓血運重建術后牙根形成有關[4-5]。隨著組織學和免疫組化技術的應用，動物實驗顯示牙髓血運重建術后大多數根管的根尖部分被新形成的礦化組織不嚴密填充，礦化組織內可見含有血管與成纖維細胞的活性結締組織[6-7]。2015年，第1例來自人類年輕恒牙的牙髓血運重建術的研究顯示，術后根管內礦化組織為牙骨質樣或骨樣組織，而未見牙本質結構[8]。牙髓血運重建術后根管內礦化組織的質量和數量與其預后效果密切相關。本文將對近年來牙髓血運重建術后根管內礦化組織相關的基礎和臨床研究進展進行綜述，就其可能機制及影響因素進行探討，并提出可促進牙髓血運重建術后根管壁礦化組織形成的策略。

1 牙髓血運重建術后根管內礦化組織的形態和種類

牙髓血運重建術后根管內礦化組織形態多樣，Song等將其大致分為鈣化屏障(calcific barrier，CB)和根管閉塞(canal obliteration，CO)兩大類，認為觀察時點不同是造成觀察到根管內礦化組織形態不同的原因，根管內礦化物質在前期形成鈣化屏障或散在鈣化，隨著礦化組織不斷沉積，最終表現為完全閉塞，但并未有足夠長期的觀察實驗證實這一點，也并未有相關文獻明確表述各種礦化組織形成的準確時間。根管內新生礦化組織根據形成機制可分為修復性牙本質、類牙骨質組織、類骨組織、根尖周硬組織長入等，其形成機制與其形態有一定關聯。

1.1 修復性牙本質

年輕恒牙的根尖孔寬大，即使根尖周感染也可能留存活髓組織。因此，牙髓血運重建術時常避免對根管進行機械預備，以盡量保留根尖的活髓組織。動物實驗顯示，當根尖存在1～4 mm無感染牙髓時，牙髓-牙本質復合體可再生[9]。新形成的牙本質小管結構排列紊亂，呈現出修復性牙本質特征[10-11]。Herwig′s上皮根鞘細胞存活時能促進牙根發育，但易受炎癥影響。在HERS細胞與根尖乳頭受損傷程度較小的情況下，根部的成牙本質細胞可形成根牙本質，牙根能繼續增長。

1.2 類牙骨質組織

張映娟等對犬無髓年輕恒牙的牙髓血運重建術研究發現，牙骨質在其根管外表面沉積，延續生長到牙根內表面，稱之為根管內牙骨質(in-canal cementum, IC)。術后3個月所有患牙內壁均出現牙骨質樣硬組織沉積，根管壁增厚及牙根長度增加[12]。除根尖周的牙骨質可直接長入根管之外，當用K銼刺破根尖周組織，將血引入根管內時，根尖周組織內的干細胞，可分化為類牙骨質細胞，形成沉積于根管內壁表面的類牙骨質組織，稱為牙本質相連礦化組織(dentin-associated mineralized tissue, DAMT)[13-14]。DAMT為類牙骨質結構但膠原幼稚結構無序，基質內幾乎無細胞。根中部牙本質表面的DAMT與牙本質壁之間結合不是特別緊密，可見部分分離，但在某些牙本質脫礦區域可見膠原纖維將兩者緊密相連。隨著時間的推移，DAMT會持續沉積直到完全封閉根管[15]。在長期根尖周感染的狀況下，根尖乳頭無法存活，HERS細胞在后期改變其形態，向間充質細胞轉化，分化為類成牙骨質細胞，此時牙根長度的增加與牙骨質樣結構沉積有關[16]。

1.3 類骨組織

根管中血凝塊內的干細胞分化為類成骨細胞時，會形成類骨組織，這些類骨組織未與根管內壁接觸，稱為骨島(bony island, BI)。BI為類牙槽骨結構，基質內含大量細胞、血管、骨髓樣組織但缺乏骨單位，有免疫組化分析顯示，BI表達破骨細胞特征性酶——抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)，提示BI除沉積外還同時發生骨改建。Lei等對人年輕恒牙的組織學研究顯示，類骨組織與類成骨細胞形成的礦化組織島可出現在根管中段[8]。BI與DAMT間存在一定關聯，BI與牙本質壁不接觸，與DAMT之間由疏松結締組織連接，在某些區域也呈現出緊密絞索連接，但BI與DAMT是否最終會完全融合尚需要更多長期實驗證實。牙髓血運重建術后根管內的主要礦化組織為類牙骨質組織與類骨組織，提示術后根管內微環境更有利于牙周膜間充質干細胞分化增殖[17]。

1.4 根尖周硬組織直接長入

當根尖孔無法正常閉合時，根尖區可產生形態不規則被結締組織包裹的鈣化團塊，內嵌針狀牙本質、較多的成纖維細胞和炎性細胞，阻礙根尖孔的閉合[13,15]。長入根管內的結締組織發生改建或牙槽骨與根管內硬組織之間形成連接時，根管內外硬組織出現相連[18]。

2 影響牙髓血運重建術后礦化組織形成的因素

2.1 根管內是否有牙髓再生

根管內是否存在能發揮生理功能的牙髓決定了新生礦化組織的性質，牙髓的原位再生并恢復其生理功能，是牙髓血運重建最理想的結果。早期研究者在術后觀察到患牙牙髓活力測試陽性[19-20]，但僅以此推測牙髓再生的成功并不嚴謹。引起牙髓電活力測試陽性的其他可能原因是：①殘余活力牙髓；②干細胞如牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)、牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化為神經元細胞[8]。只使用X線片與牙髓電活力測試難以評價牙髓血運重建術后的礦化組織是否為牙本質以及是否有牙髓再生。目前，有學者在活性生物材料與干細胞方面研究，致力于創造適宜微環境促使干細胞向成牙本質細胞定向分化，并有實驗觀察到牙髓樣結締組織形成，但其結構與功能尚待進一步研究[21-22]。

2.2 根管感染程度

根管感染嚴重程度會影響根管內礦化組織沉積性質和形態。根管內感染消除不徹底的患牙，根管內炎性細胞常與新生牙骨質樣組織并存，壞死細胞殘片與牙本質碎片嵌入其中，周圍包繞新生結締組織[23]。另外，與無感染組相比，感染組新生牙骨質的量更少[12]。Stambolsky等對犬牙的組織學研究表明當感染極嚴重或極輕微時，形成礦化物的概率較低[24]。嚴重感染可能會影響根尖周干細胞生存的微環境，同時影響引血后血凝塊發揮正常支架作用，造成血運重建的失敗；當使用高濃度抗生素對根管進行化學清理，會同時產生細胞毒性作用，導致礦化組織形成減少。牙髓血運重建術的臨床病例顯示，失敗病例多與持續感染相關[25]。劉彩霞等報道了10例年輕恒牙牙髓血運重建術后病例，所有患牙都有不同程度根管壁的增厚，但有部分感染較重的根尖周炎患牙根尖孔未閉合[10]。

2.3 根管內生物支架

2.3.1 血凝塊 根管內血凝塊通常來源于根尖周組織，在牙髓血運重建中起到重要作用：第一，血凝塊內的膠原起到支架作用，可為干細胞的增殖分化提供空間。第二，血凝塊的引入更容易將根尖周細胞帶入根管，作為成牙骨質細胞與成骨細胞的前體細胞來源。第三，血凝塊中的血小板存儲和分泌活性生長因子、多種細胞黏附分子，均有利于根管內礦化組織沉積。

2.3.2 血制品支架 富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)，是自體全血經離心后得到的血小板濃縮物，可形成三維纖維網絡，比普通血凝塊富含更高濃度生長因子，是一種高效的支架。Alagl等研究顯示使用PRP支架可顯著增加根長[26]。近年來還有第3代血小板濃縮制品，濃縮生長因子纖維蛋白(concentrated growth factors, CGF)，以CGF產品作為干細胞增殖和分化的支架，有利于提高牙髓再生的成功率[27]。

2.3.3 人工合成支架 隨著應用于口腔醫學領域生物材料的飛速發展，各種人工合成材料，如納米纖維、纖維蛋白凝膠也被用于牙髓血運重建術研究中。人造交聯膠原支架使用純化的Ⅰ型膠原，形成不可溶的膠原網絡，提供穩定的微環境，更有利于干細胞的黏附和生長。有實驗表明，使用交聯膠原支架比僅使用血凝塊能更顯著提高根管內礦化組織沉積程度。商品化膠原蛋白膜的使用可促進患牙根中1/3的牙本質壁的發育[28]。

磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是一種具有生物學活性的新型非陶瓷型羥基磷灰石類人工骨材料，具有“骨引導性”和可降解性，且封閉根尖完全，抗菌抑菌效果好，炎癥下仍可誘導根尖孔閉合[29]。人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)和人成骨細胞(human osteoblast, HOB)共培養方法成功地在CPC+RGD序列(由精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸組成)上生成了微毛細管樣網絡[30]。新型膠原蛋白-羥基磷灰石支架的使用誘導新礦化組織形成，在原牙本質表面形成類牙骨質組織[31]。這類磷酸鈣支架常以礦化物質充滿根管從而提高牙根機械強度為最終目標。

2.3.4 與干細胞結合支架 牙髓血運重建術的成功與否離不開干細胞、生長因子、支架這三大要素[32]。眾多研究致力于再生具有形成牙本質功能的牙髓組織，常用干細胞有人脫落乳牙干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、PDLSCs、DPSCs、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)等。有學者將人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)與納米生物玻璃涂層牙本質于裸鼠體內培養，觀察到牙本質表面的細胞黏附和牙源性分化[33]。目前認為干細胞參與組織的再生與修復；生長因子促進干細胞的增殖與分化；支架作為一種三維結構的支持物，可供干細胞的黏附，并為其增殖和分化提供非常有利的環境。干細胞微環境中的生物分子，例如TGF-β、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、Nfic(nuclear factor I C)、WNT通路信號傳導分子、抗菌肽LL-37、血管緊張素Ⅱ等都可以影響干細胞的分化方向[34-36]，Zarei等對犬牙進行實驗，用蜂膠誘導VEGF和Ⅷ因子，新生硬組織由牙骨質樣組織和其他礦化組織構成[37]。有學者用外源性牙本質制備牙本質基質支架，為牙髓干細胞提供具有生物活性的細胞外基質，動物實驗顯示修復性牙本質再生[38]。有學者指出，單獨使用PRP支架與引血產生血凝塊的患牙在根長與根管直徑的變化方面無明顯差異，但PRP支架與干細胞結合使用后結果令人滿意[39]。Zhu等[40]將高生長因子支架PRP與牙髓干細胞結合，發現了軟組織和硬組織的形成增加，Chai等觀察到人牙髓干細胞分化為成牙本質細胞并形成修復性牙本質[41]，但Torabinejad等的類似實驗結果出現牙根內吸收、根尖周肉芽腫等病態變化[9]。另外有學者稱支架和生長因子對牙根發育和根尖周愈合方面沒有明顯作用[42]，因此對干細胞結合生物支架的機制及精確調控仍需進一步研究。

3 促進牙髓血運重建術后根管內礦化組織形成的臨床決策

AAE給出了牙髓血運重建術的三級結局指標，第一級為消除癥狀并有骨愈合，第二級為根部厚度和/根部長度的增加，第三級為活力測試陽性[43]。臨床操作前后的診療決策將影響牙髓血運重建術術后根管內礦化組織的形成。

第一，對根管內礦化組織性質的預期。根管內礦化組織的性質與數量與預后息息相關，最理想的結果是形成修復性牙本質，最不理想的則是根尖周硬組織直接通過開放的根尖孔與根管內硬組織相通。由于牙髓組織再生的技術尚不成熟，目前根管內礦化組織為類牙骨質組織的情況能滿足AAE的第一級和第二級指標，并獲得較好的預后[44]。有文獻指出，根管內形成類牙骨質礦化組織的預后優于類骨礦化組織[45]，即DAMT有序形成的預后優于BI。無法完全封閉的根尖常與BI并存[46]，BI的存在可能是牙髓血運重建失敗率較根尖誘導成形術更高的原因之一[44]。對牙本質進行一定的脫礦處理，例如增加乙二胺四乙酸(EDTA)沖洗步驟，可使牙本質表面形成毛發狀突起結構，使DAMT與牙本質間形成鎖結連接形式，可促進DAMT的生成并提高新礦化組織與原根管的附著強度。

第二，術中可采用一些措施來減少根管感染，提高礦化組織形成的量和質量。①使用適宜濃度的三聯抗生素溶液(環丙沙星、甲硝唑和米諾環素)。新近研究顯示，除了對根管系統進行消毒外，環丙沙星和甲硝唑的組合還具有免疫調節作用，可能有助于根尖愈合[47]。②優化沖洗方案。有研究顯示，濃度為6%的高濃度次氯酸鈉溶液比1.5%濃度更有利于促進牙根增長[48]。輔以17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液或納米氣泡增強型抗菌劑等，進一步去除牙本質玷污層，提高抗菌效果[49]。③使用人工支架可減少感染。相比形成血凝塊的病例，使用PRP等人造支架發生根尖周炎癥比例更低，且出現根管完全鈣化的可能性也明顯降低[50-52]。④選擇性能更佳的蓋髓劑。蓋髓劑密封滅菌效果與術后根管炎癥相關，有文獻指出，iRoot BP比廣泛使用的傳統蓋髓劑礦物三氧化物凝聚體(mineral trioxide aggregate, MTA)更適宜于炎癥酸性環境，可提高牙本質表面牙骨質樣沉積率，從而提高血運重建成功率[53]。有文獻報道，iRoot BP Plus和MTA可對BMMSCs的成骨或成牙分化方向產生影響，鈣離子與硅離子含量更高的iRoot BP Plus將誘導更多礦化組織的形成[54]。

第三，術后是否干預。當牙髓血運重建實現第一級或第二級目標后，有兩種方案可供選擇。①在不出現癥狀的情況下不加干預，直至根管完全鈣化。根管內礦物的沉積速度難以預測，眾多因素可導致根管內鈣化的不均勻，甚至完全鈣化。目前尚無確切證據顯示牙髓血運重建術后根管鈣化會影響根尖周炎愈合和根長發育，且鈣化根管的疏通難度大，因此，無癥狀時不建議干預[55-56]。②隨訪觀察，在合適的時機進行常規根管治療，用牙膠尖充填，但充填時機尚未取得共識。這一策略有其合理性。某些維度根管看似封閉，其實根尖部分區域仍是開放的[46]。利用部分封閉的根尖完成根管治療，可避免未完全封閉的根尖帶來根尖周感染風險。但新生礦化組織與牙本質壁的結合強度有待進一步檢驗，常規根管治療可能影響這種結合，反而破壞已經封閉的根尖區域，最終造成治療的失敗。對根管充填的時機及提升牙髓血運重建術療效的方法還需進一步研究。

綜上所述，牙髓血運重建術可提高部分牙髓或根尖感染年輕恒牙的治療效果，術中可通過控制根管感染，人為控制支架、干細胞、局部微環境等方式促進牙髓血運重建術后根管內礦化組織的有序形成，但仍需要大量研究和臨床隨訪觀察對相關因素加以驗證，提高遠期療效。