唾液細胞外囊泡miRNA-143/145與雌激素缺乏性骨質疏松相關性的臨床研究

沙 莎，陸玲波，郭培培，陳 姝，靳牧涵，徐榮耀,3

骨骼具有機械支持、保護臟器、儲存鈣磷、造血等功能，這些功能的維持需要骨組織處于骨形成和骨吸收的動態平衡，即需維持骨穩態(bone homeostasis)[1]，中老年女性在絕經后常因雌激素水平驟降導致骨穩態失衡引起骨質疏松[2](即原發Ⅰ型骨質疏松)。絕經期后骨質疏松主要表現為骨密度及骨再生能力降低，危害患者健康[3]；如累及頜骨將直接導致種植牙成功率下降，拔牙創口愈合緩慢，骨折發病率增加等[4]。因此，絕經后骨質疏松早期診斷對提高患者后續生活質量有重要意義。目前，對骨質疏松的診斷主要基于骨密度測定、影像學檢查及必要的生化檢查等[5]，過程較為繁瑣，有待尋找更為簡單便捷的診斷方法。

所有細胞均可釋放細胞外囊泡，細胞外囊泡是由脂質雙分子層構成的杯狀結構，內含許多細胞成分，包括DNA、RNA、脂質、代謝物、細胞質和細胞表面蛋白等，存在于多種體液(包括血液、唾液等)中，參與各種細胞間的通信[6]；而微小RNA(microRNA, miRNA)是細胞外囊泡中主要的核酸。miRNA是一類在轉錄后水平調控基因表達的內源性非編碼小RNA[7]，長度為18～25個核苷酸；近年來miRNA因能調控成骨細胞、破骨細胞和骨髓基質細胞(BMSCs)生長分化和衰老而在骨質疏松的預防、診斷和治療中成為新的靶點[8]；同時，我們在多篇文章中發現miRNA-143和miRNA-145在骨質疏松的進程中發揮重要作用[9-11]，并在公共數據庫TAM2.0: A tool for miRNA Set Analysis (http://www.lirmed.com/tam2/)中針對骨質疏松(osteoporosis, postmenopausal)的特征性miRNAs進行分析，結果顯示miRNA-145與絕經后骨質疏松相關；在分析其來源上(cell specificity)，間充質干細胞在由于衰老或絕經導致的成脂分化能力增強的過程中，miRNA-145的表達升高，而骨髓組織作為間充質干細胞的主要來源，進一步提示miRNA-145的表達水平可能與骨量的變化有關。因miRNA-143和miRNA-145均位于人類第5號染色體上，兩者共用一個啟動子和一條pri-miRNA，且被報道發揮類似的功能，故本項目旨在探究唾液細胞外囊泡源miRNA-143/145與雌激素缺乏性骨質疏松的發病是否具有相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

女性的牙槽骨取自2020年1月—2021年6月在南京醫科大學附屬口腔醫院因磨牙至少缺失1年而接受牙植入術的志愿捐贈者，共12例；在牙植入手術中，我們使用φ3.0 mm取骨環鉆獲取絕經前后女性牙槽骨下頜第一磨牙位置對應的缺牙區來分析松質骨骨密度的差異，以此避免不同牙位的影響。

《中國老年骨質疏松診療指南》指出檢測骨密度為診斷骨質疏松癥的重要指標之一，雖然雙能X線骨密度測量(dual X-ray absorptiometry，DXA)是診斷骨質疏松的主要方法，但其具有局限性。首先，DXA只是一種二維(2D)技術，僅量化面積骨密度(bone mineral density, BMD)(g/cm2)，不提供體積(3D) BMD測量(mg/cm3)；其次，DXA不能提供皮質孔隙度等骨三維微結構的信息，也不能區分皮質骨和骨小梁骨密度，在區分如骨質疏松(OP)和表現為骨軟化(OM)的代謝性骨病方面有一定局限性[12]；另一方面，肥胖也在一定程度上降低了DXA測量的精度，減肥患者由于體重的減輕容易在DXA圖像中引起偽影[13]，這對BMD的結果產生了較大的影響；此外，用DXA測量老年人脊柱和髖關節骨密度時易受到某些退行性病變(如腰椎骨贅或主動脈鈣化)的影響，從而誤將骨密度提高，低估了這些患者真正的骨折風險[14]；而定量CT作為測量真實體積骨密度的方法，能將皮質骨和松質骨分開評價，不受脊椎增生退變和血管鈣化等因素影響，在測量腰椎各椎體間骨密度時準確性明顯高于DXA[15]。因此本實驗使用錐形束CT機拍攝上述12例患者的顱頜面CBCT影像，獲取第三、第四頸椎骨密度以對絕經期前后女性骨密度進行側面分析。

納入標準：①無頜骨腫瘤或腫瘤樣病變；②未攝入影響骨代謝的藥物(糖皮質激素、抗癲癇藥物、抗結核藥物、含鋁抗酸劑、肝素)；③無影響骨代謝和生長發育的系統性疾病(甲狀旁腺功能亢進、甲狀旁腺功能減退、骨軟骨病、腎性骨營養不良、畸形性骨炎、成骨不全、糖尿病)；④無頸椎疾病或外傷史；⑤顱頜面CBCT影像清晰，無明顯形態和結構異常，第三、第四頸椎輪廓清晰可辨。

同時收集因骨折、正頜、植牙或阻生牙拔除手術住院患者的血清和唾液(2018年6月—2019年6月)。中國的大部分女性絕經期是在45～55歲，并且為了避免年齡因素造成的干擾，我們選擇9例40～45歲女性患者作為絕經前組，10例55～60歲作為絕經后組。對于血樣和唾液的收集，早晨在患者未進食狀態下采集血液，血樣離心取血清樣本進行后續檢測。同時，在患者清晨未進食且未受刺激的情況下收集唾液樣本，使患者取坐位，頭稍前傾，舌頭的尖端壓在上下顎或下頜骨上，輕輕地將唾液吐到采集漏斗中，直到液體的唾液(無氣泡)達到近5 mL為止；手持唾液采集管,保持直立，另一只手按壓采集漏斗，使漏斗中的唾液流入下方采集管；旋轉漏斗,使其從下方采集管脫離，移除漏斗裝置后，取出密封蓋，旋緊蓋子，對采集到的唾液樣本進行封存；將采集管反轉5次，使唾液和唾液保存溶液充分混合；盡快將收集好的唾液-80 ℃保存備用。

CBCT影像使用和血清、唾液樣本采集均由研究對象本人知情同意并簽字，本試驗經南京醫科大學口腔醫學院倫理委員會批準(PJ2020-110-001)。

1.2 實驗儀器與試劑

micro-CT分析 (Skyscan1176, Bruker, 比利時)；NewTom VG型錐形束CT機(NewTom VG, QR s.r.1,意大利)；ELISA試劑盒(武漢優生爾商貿,中國)；QIAGEN試劑盒(Valencia, CA, 美國)；一體化miRNA qRT-PCR檢測試劑盒(GeneCwopole，Rockvill，美國)；透射電子顯微鏡(TEM，日本電子)。

1.3 試驗方法

1.3.1 絕經期前后女性牙槽骨樣本micro-CT圖像對比 分別取6例絕經前后女性患者牙槽骨樣本用于micro-CT分析。在牙植入手術中，我們使用φ3.0 mm取骨環鉆獲取絕經期前后女性牙槽骨下頜第一磨牙位置對應的缺牙區。將牙槽骨固定于micro-CT(Skyscan1176，Kontich，比利時)樣本臺進行掃描獲得圖像，掃描條件：電壓為50 kV，電流為456 μA，掃描層厚為18 μm。將掃描所得數據導入NReconv1.6和CTAnv1.13.8.1軟件，重建和分析骨骼的三維圖像。

1.3.2 檢測絕經期前后女性頸椎骨密度 根據中國最新定量CT診斷指南(BMD>120 mg/cm3，正常；80 mg/cm3

1.3.3 檢測血清樣本中雌激素水平 采用ELISA法檢測血清樣本中雌激素水平，相關操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 提取血清和唾液中細胞外囊泡 使用超速離心法提取血清和唾液中的細胞外囊泡。將血清樣本移至新的離心管內，2 000×g，4 ℃，30 min離心；取離心獲得的上清液，12 000×g，4 ℃，45 min第2次離心；將第2次離心獲得的上清液通過0.45 μm濾膜過濾；取過濾液移至新離心管中， 110 000×g，4 ℃，70 min超速離心；棄上層清液，用PBS重懸沉淀，再次110 000×g，4 ℃，70 min超速離心；離心后棄去上清液，所得沉淀即為血清細胞外囊泡，用PBS重懸后，-80 ℃保存。取3 mL收集的唾液于離心管中，加入30 mL生理鹽水稀釋后，重復上述從血清樣本中提取細胞外囊泡的步驟從唾液中提取細胞外囊泡。

1.3.5 觀察提取的細胞外囊泡 取先前分離的細胞外囊泡懸液(約10 μL)，當沉淀后去除浮液，常溫干燥數分鐘，采用透射電子顯微鏡(TEM)在80 kV下拍攝電鏡照片，觀察細胞外囊泡形態。

1.3.6 檢測血清和唾液樣本中miRNA-143/145水平 根據QIAGEN試劑盒說明書提取血清和唾液細胞外囊泡中的miRNA-143/145，再用一體化miRNA qRT-PCR檢測試劑盒(GeneCwopole，Rockvill，美國)進行純化檢測。由于在miRNA的檢測過程中缺乏穩定并且公認的內參基因，故在miRNA提取時加入ce-miR-39作為外參基因，以標準化miRNA的表達。采用2-ΔΔCT方法進行數據分析，表示miRNA-143/145的表達水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，結果用均值±標準差表示。試驗至少獨立重復3次。兩組間數據比較采用Studentt檢驗進行分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 絕經后女性骨密度下降，呈現骨質疏松的趨勢

通過micro-CT對比分析絕經期前后女性牙槽骨樣本發現，絕經后骨皮質厚度沒有明顯的變化，但松質骨的骨小梁數目減少、變細變薄，小梁間隙變寬(圖1)。通過對松質骨進行骨參數分析結果顯示，BV/TV和BMD的值都呈現下降的趨勢(圖2)。

圖1 絕經期前后女性牙槽骨micro-CT影像圖Fig.1 Micro-CT images of alveolar bone in premenopausal and postmenopausal women

2.2 雌激素水平下降時，骨密度水平也下降

分析19例絕經前后女性樣本中的雌激素水平與骨密度的相關性，發現當雌激素水平下降時，骨密度水平也下降(圖3)。

圖3 雌激素水平與骨密度水平呈正相關Fig.3 Estrogen levels are positively correlated with BMD levels

2.3 透射電鏡下觀察血清和唾液中細胞外囊泡形態

通過透射電鏡對細胞外囊泡進行形態學觀察，可以清晰地看到從血清中提取的細胞外囊泡為雙層膜樣結構，呈現較均勻的杯狀，直徑在100～140 nm(圖4A)。進一步觀察稀釋唾液中提取的細胞外囊泡，雖可見唾液中的一些其他雜質，但總體上可以清晰看到細胞外囊泡呈較均勻杯狀的雙層膜樣結構，直徑在100～200 nm(圖4B)。

*：P<0.05

A：血清中細胞外囊泡(紅色三角所指)；B：稀釋唾液中細胞外囊泡(紅色三角所指)

2.4 血清中的miRNA-143/145水平與雌激素水平呈負相關

檢測19例絕經前后女性血清樣本中的雌激素水平以及血清細胞外囊泡中的miRNA-143/145水平，發現血清中miRNA-143水平隨著雌激素水平的下降而顯著上升(圖5A);與此同時，miRNA-145水平也隨著雌激素水平的下降而顯著上升(圖5B)，即miRNA-143和miRNA-145水平均與雌激素水平呈負相關。

A：血清中miRNA-143含量與雌激素呈負相關；B：血清中miRNA-145含量與雌激素呈負相關

2.5 唾液miRNA-143/145水平與雌激素水平呈負相關

檢測上述唾液樣本細胞外囊泡中的miRNA-143/145水平，發現當雌激素缺乏時，miRNA-143水平較高(圖6A)，而miRNA-145也處于較高的表達狀態(圖6B)，說明在唾液樣本中miRNA-143/145水平也與雌激素水平呈負相關，與血清樣本中細胞外囊泡的檢測結果具有良好的一致性。

3 討 論

雌激素缺乏性骨質疏松是女性在絕經期后由于雌激素水平驟降，破骨細胞增殖分化活躍、凋亡減弱、活性增強，成骨細胞增殖分化減少、活性下降，導致骨穩態失衡、骨內部結構紊亂及骨量丟失引起的骨質疏松[16]；早期因無明顯癥狀易被忽視，但隨著病情的進展、骨量的不斷丟失，患者易感乏力骨痛，在跌倒摔落等意外情況發生時極易骨折[17]，甚至在后期可出現駝背等脊柱嚴重畸形的情況。柴波等[18]研究結果表明我國50～59歲絕經后女性骨質疏松癥的患病率約為20.38%， 因此， 對雌激素缺乏性骨質疏松的及時診斷顯得尤為重要。

A：唾液中miRNA-143含量與雌激素呈負相關；B：唾液中miRNA-145含量與雌激素呈負相關

本試驗通過觀察絕經期前后女性牙槽骨micro-CT影像學結果，檢測骨密度和雌激素水平，對比分析血清和唾液中miRNA-143/145水平與雌激素的相關性，發現女性絕經期后隨著雌激素水平的下降，骨密度水平也下降，而血清和唾液中miRNA-143/145水平均隨著雌激素水平的下降上升。Weivoda等[8]的研究也證實miRNAs可與多個調控成骨和破骨相關的基因結合，在翻譯水平調控基因的表達，從而參與骨骼的發育、穩態和老化等生物過程，提示miRNA-143/145檢測對雌激素缺乏性骨質疏松有一定臨床診斷價值。但血清或唾液中游離的miRNAs極不穩定，易被RNA酶部分降解，所以在本試驗中我們研究細胞外囊泡中的miRNA。

研究表明，細胞外囊泡由多種細胞分泌，并釋放到細胞外，以胞吞轉運的方式穿過如血腦屏障等上皮屏障，幫助運輸一些系統來源的分子成分(包括許多類型的DNA、RNA、蛋白質等)從血液進入唾液。基于其起源以及較小的尺寸，細胞外囊泡參與許多信息傳遞的過程，包括細胞內通信、程序性細胞死亡、血管生成、免疫反應、細胞和組織穩態、炎癥、凝血、細胞遷移、細胞分化等，與細胞生理和病理過程相關[19]。由于細胞外囊泡為脂質雙層膜結構，不易被降解且能夠保護其內容物免受RNase損傷和其他因素的干擾，所以不僅細胞外囊泡中的miRNA更加穩定、豐度較高[20]，并且細胞外囊泡本身在循環中高度穩定[21]，其內容物和含量的變化多由特定的生理病理條件所引起，因此可以更靈敏地反映受檢者的生理病理狀態。

人體唾液大部分為水分，還有黏多糖、黏蛋白、唾液淀粉酶、溶菌酶、過氧化物酶等多種有機物以及鈉、鉀、鈣、氯、碳酸氫根等無機物。由于唾液具有與外界、日常飲食直接相通的特點，唾液中的內容物會受細菌、飲食等各種因素的影響，其中游離的分子成分也較容易被降解，對于定性定量而言是一個難題[22]。本試驗選擇提取唾液中的細胞外囊泡，這樣在一定程度上降低了唾液本身內容物的復雜性，又減少了細菌等雜質來源的干擾；同時，又因為細胞外囊泡本身為脂質雙層結構，能夠保證其內miRNA含量的穩定性，免受RNase損傷和其他因素的干擾。與游離的miRNA檢測相比，結果更加穩定可靠，所以唾液細胞外囊泡中miRNA表達更多反映的是受檢者的生理病理狀態，而非飲食、細菌等因素的影響。此外，本試驗發現唾液樣本與血清樣本中miRNA-143/145的檢測結果具有良好的一致性，而相較于采集血樣，采集唾液有如下優點：①采樣具有無創性，易于重復多次采樣；②采樣流程較簡單，易于操作；③采集的唾液易于處理和儲存，張春紅等[23]研究發現，當大范圍收集樣本時，唾液樣本更適合在多個實驗室和收集點之間傳送，更有利于跨實驗室間的合作。基于上述優點，提出可通過采集唾液以代替采集血樣進行檢測，并且可以考慮建立范圍更大、覆蓋更廣的唾液樣本庫，進一步研究雌激素缺乏性骨質疏松時miRNA-143/145的變化水平，提高通過miRNA-143/145水平診斷雌激素缺乏性骨質疏松的準確性。

唾液檢測提供了一種新的、非侵入性的、更為簡單的方法來幫助診斷雌激素缺乏性骨質疏松。人體口腔頜面部作為全身礦化組織最多的區域，骨質疏松也會引起頜骨骨量減少、骨密度下降、骨微觀結構破壞以及牙槽骨吸收等情況的發生[24]，可能會影響牙齒的牢固性而引發松動，若病情進一步發展，牙齒最終會脫落，導致咀嚼功能的喪失和語音功能的損害。長期牙列缺損將導致牙槽嵴低平，加大了對絕經后女性進行正畸治療的難度[25]。當頜骨骨密度下降時，還會對口腔微環境造成影響，加快牙周炎致病菌的生長繁殖，引起牙周炎的持續感染；孫鵬飛等[26]研究發現骨質疏松者較正常人更易患牙周炎。此外，在對缺失牙的種植修復過程中，低于正常水平的骨密度可能會影響種植體植入初期的穩定性，造成種植體骨整合質量下降，后期易松動脫落，也有造成種植體邊緣性骨吸收的風險[27]。因此，及時診斷雌激素缺乏性骨質疏松并加以治療，對于牙周病的防治、種植牙成功率的提高、骨皮質切開術的療效、頜面部手術后骨缺損的再生等方面有較大幫助。

綜上所述，本研究結果表明唾液細胞外囊泡中miRNA-143/145水平與雌激素缺乏性骨質疏松有一定聯系，通過檢測其水平來診斷雌激素缺乏性骨質疏松不失為一種更安全便捷的診斷方式，未來在雌激素缺乏性骨質疏松的診斷中也許有更光明的應用前景。