蠟樣芽胞桿菌毒素的最新研究進展

賈偉娟 宋麗麗 張玲艷 王學理

(內蒙古民族大學動物科學技術學院， 通遼 028042)

蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)為兼性厭氧，產芽胞的革蘭陽性桿菌。該菌屬芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，其大小為(1.0～1.2)μm×(3.0～5.0)μm，在8℃～55℃條件下可存活，但在環境pH較低(≤2)或含水量較低(≤0.95)時無法生存[1]。該菌形成的熱穩定性孢子具有耐熱、耐干燥、耐部分有毒化學物質及UV與γ射線等不利因素的特點[2]。蠟樣芽胞桿菌為一種常見的條件致病菌，該菌與蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌等細菌的16S rRNA及生物學特性具有高度的相似性[3]。蠟樣芽胞桿菌分為有毒菌株與無毒菌株，無毒菌株常被用作促植物生長劑及動物飼料內的微生物添加劑[4]。有毒菌株可引起動物和人類的食物中毒，偶見由該菌引起的皮下膿腫、眼部感染、菌血癥等疾病[5]。臨床上感染該菌后宿主多表現為嘔吐與腹瀉，嘔吐癥狀是由該菌株產生的嘔吐毒素(cereulide)所引起，而腹瀉癥狀則主要由溶血型腸毒素Hbl(hemolysin BL)、非溶血型腸毒素Nhe(nonhemolytic enterotoxin)、細胞毒素CytK(cytotoxin)及其他幾種腹瀉型毒素引起[6]。此類產毒菌株多見于人類的食物中毒，早在1970年，美國就曾報道過由蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒，且在1998—2008年期間，美國每年發生940萬例的食源性疾病中有130萬例是由蠟狀芽胞桿菌引起的[7-8]。在1977—2013年，德國、韓國和日本也相繼出現由該菌導致的中毒事件，我國在1972—2018年期間，云南、江蘇和北京等39個城市均報道過蠟樣芽胞桿菌食物中毒事件[9-12]。通過數據整理后發現引起惡心、嘔吐癥狀的污染食品大部分為米飯、包子和意大利面等淀粉含量較多的食品，導致腹痛、腹瀉癥狀的主要食品有雞蛋、肉類、乳制品和水產品[13]。對于該菌引起的食物中毒除抗生素外尚無其他有效治療藥物，由于藥物與宿主之間的相互作用導致抗生素在宿主體內會產生副作用也容易導致耐藥菌株的出現，因此抑制該菌的新的藥物還在研發中。目前，有學者在蠟樣芽胞桿菌中發現了新的藥物靶點，將抗生素通過Schr?dinger的Prime和Glide模塊進行分子模擬和對接研究，其中慶大霉素與已鑒定的新靶點具有良好的親和力[14]。因此可以通過尋找與慶大霉素類似的抑制劑并設計新的藥物分子來控制蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒。近年來動物感染該菌的報道也日漸增加，在通遼地區已發現多起牛猝死病例。本實驗室從通遼市某肉牛養殖場病死牛體內分離出1株蠟樣芽胞桿菌，動物致病性試驗結果發現該菌具有較強的致病性，經PCR檢測該菌含有hbl、nhe、entFM等毒素基因以及管家基因groEL[15]。本文主要對蠟樣芽胞桿菌的cereulide、Hbl、Nhe、CytK及HlyII等毒素的結構、功能及致病機制進行闡述，以期能為今后蠟樣芽胞桿菌的研究提供理論基礎，并為本實驗室的下一步工作奠定基礎。

1 嘔吐型腸毒素

蠟樣芽胞桿菌致吐株(bcemetic strains, Bce)可產生嘔吐毒素(cereulide)，該菌株在亞洲較為常見，在淀粉類食品(米飯、土豆、面條等)中檢出率較高，除此以外乳制品也為該菌的常見污染體[16]。在食入含有cereulide的食物0.5～6 h后，宿主會出現惡心、嘔吐癥狀，嚴重者會發生肝衰竭而迅速死亡。現階段在食品加工中還無法應用常規手段使cereulide失活。

Cereulide的分子量大小為1.2 kDa的一種環形十二烷基肽，由非核糖體肽合成酶合成，其結構為[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]3，如圖1所示[12,17]。Cereulide的合成受細菌內部因素及外界環境的共同調控。Bce在30℃～32℃，pH為7.0～7.5時的條件下產毒量最高，在細菌生長的對數期至穩定期期間Bce的產毒量逐漸減少。環境中的氧氣含量、營養物質及水分等其他環境因素也會影響該毒素的產生。此外，細菌的密度也是影響產毒的因素之一，研究表明，當蠟樣芽胞桿菌的密度達到閾值106CFU/mL時菌體開始產生毒素[18]。Cereulide較為穩定，耐高溫，在126℃條件下可耐受90 min，且該毒素對消化酶具有很強的抵抗力。ces為控制合成cereulide的基因簇[NC_010924.1]，大小為24 kb，位于pBCE4810(也稱pCER270)巨型質粒上，與炭疽桿菌的毒性質粒pXO1具有高度相似性[19]。pBCE4810由cesH、cesP、cesT、cesA、cesB、cesC和cesD組成，如圖2[20]。其中cesPTABCD組成一個操縱子(cesoperon)，在主要啟動子p1的驅動下轉錄成一條23kb的多順反子mRNA鏈，而相鄰的cesH由自身啟動子PH驅動轉錄成單順反子，并編碼31 kDa的水解酶[21]。cesP編碼的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶為非核糖體合成起始的重要元件，與其相類似，cesT也參與酶的合成。而cesA與cesB因對NADPH有高度親和性，故在多肽組裝時會起到重要作用[22]。cesC與cesD參與編碼ABC轉移體[23]。

當蠟樣芽胞桿菌伴隨食物進入機體后，cereulide自胃內釋放進入十二指腸與5-HT3受體結合干擾神經感受器的信號傳入，從而刺激迷走神經引起嘔吐癥狀進而導致腸胃炎的發生[24]。Cereulide做為陽離子載體除與線粒體毒肽纈氨霉素在結構上具有相似性以外，在功能上也同樣為特異性K+載體，且其對K+的親和力高于纈氨霉素，即該毒素對哺乳動物毒性更強[25]。Cereulide對機體的損傷主要體現于對線粒體的破壞，該毒素引起線粒體膜上K+濃度升高，使線粒體發生腫脹、膜電勢消失，從而使呼吸功能受到影響，此外，cereulide也會通過抑制脂肪酸氧化，來抑制線粒體活性，如圖3[26-27]。Cereulide還可抑制自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)從而影響免疫，也會引起肝細胞變性進而引發急性肝衰竭，如圖3[27]。據報道，cereulide在極低濃度下(4ng/g)能破壞胰島B細胞，導致細胞凋亡和胰島功能異常[28]。因此可猜想部分糖尿病的病因是與食入cereulide有關聯。Bce除對動物機體產生作用外，也會對其他不產生嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌產生抑制作用。在土壤中，cereulide會幫助Bce搜取環境中的鉀離子來保護菌體，此外Bce可抗真菌以實現對植物塊莖的保護作用[29]。

對于該毒素的檢測一直較為困難。最初對該毒素的檢測是對猴子進行投喂試驗。之后發現cereulide可使Hep-2細胞產生空泡化現象便以此來檢測該毒素。Cereulide可損傷線粒體活性進而抑制豬精子的運動，該方法也被應用到cereulide的檢測中。以上檢測方法均不能檢測到毒素本身，而在2004年Ehling-Schulz等[30]開發了針對ces基因的PCR檢測技術，自此實現了對該毒素的快速檢測。

2 腹瀉型腸毒素

蠟樣芽胞桿菌所產生的腹瀉型腸毒素主要分為3類：溶血性腸毒素Hbl、非溶血性腸毒素Nhe與細胞毒素K(CytK)，此外腸毒素II(HlyII)、腸毒素FM(entFM)、腸毒素T(bceT)也具有致腹瀉作用[31]。其中，Hbl與Nhe毒素為引起腹瀉的主要毒素。據王遠洋等[32]統計顯示，食品內所檢測出的蠟樣芽胞桿菌中53.1%含有hbl基因，nheA、nheB和nheC的檢出率分別為65.6%、90.6%、87.5%，entFM與bceT的檢出率分別為96.9%和53.1%。由此可見腹瀉型腸毒素在產毒芽胞桿菌中的存在率較高。宿主在攝入腹瀉型腸毒素8～16 h后會表現出明顯的腹瀉癥狀。與嘔吐毒素相區別，腹瀉型腸毒素對外界的抵抗力較弱，55℃條件下作用5 min即可失活，此外腹瀉型腸毒素易被胰蛋白酶等蛋白質水解酶分解，因此該類毒素較容易被去除[33]。

2.1 溶血性腸毒素

Hbl為腹瀉型腸毒素的主要毒素之一，該毒素具有溶血性及細胞毒性，可導致皮膚壞死并增強血管通透性[34]。Hbl是由溶血毒素亞基L1、L2及亞基B結合而成的三元素復合體，各亞基的分子量大小依次為38.5、43.5和37kDa(圖4)[12]。Hbl基因由hblA、hblB和hblC和hblD4個毒力基因組成，而有些Hbl會存在hblB的缺失現象。hblA、hblC、hblD分別控制L2、L1及B蛋白的合成，而位于hblCD下游的hblB因未曾檢測到其任何轉錄現象，因此被定義為假基因。hbl操縱子的表達受多種調節蛋白的影響，如主要的毒力調節因子PlcR、CCPA、ResD和FNR[35]。編碼合成Hbl的毒力基因多位于染色體上且幾種毒力基因間相似性較高，因此3種毒素亞基存在同源異構現象[36]。

Hbl對細胞的破壞主要針對于細胞膜，通過Hbl的3個亞基依次與細胞膜進行結合，之后將結合部位的細胞膜溶解，形成孔洞，從而破壞細胞膜，如圖5所示[27,37]。有研究表明，3種Hbl組分均能與紅細胞結合，形成膜攻復合物，最終導致細胞裂解。在與細胞表面結合時，各毒素亞基須嚴格按照B-L1-L2的順序進行結合才會產生細胞毒性。hblB與大腸埃希菌的溶血素E相似，該蛋白自身具有與細胞膜結合并打孔的功能，但當其作用于細胞時需在L1與L2的共同誘導下使構象發生改變后發揮細胞毒性作用。除結合順序外，3種亞基的占比也是影響Hbl細胞毒性的關鍵因素。當環境中L2:L1:B=1:1:10與10:1:10時，細胞膜的孔隙形成速度最快[38]。

目前，Hbl的具體作用方式尚不清楚，除上述作用外，Hbl也會引起結扎的兔回腸發生積液[39]。近年有研究表明，Hbl可通過胞膜打孔導致K+外流，進而激活NLRP3炎癥小體從而導致宿主的死亡，如圖5[27,40]。與炭疽芽胞桿菌的致死毒素不同，Hbl無胞質依賴性，可直接刺激NLRP3，因此該毒素對宿主的致死作用可通過藥物對NLRP3的抑制來進行預防[35]。

2.2 非溶血性腸毒素

在1995年挪威的食物中毒事件中Nhe首次被分離[41]。該毒素具有細胞毒性，但與Hbl不同，Nhe的溶血性較差，僅能作用于特定動物的紅細胞[42]。Nhe最初被認為是由nheA、nheB及可檢測到的大小為105 kDa的蛋白組成，隨后該蛋白被證實為膠原酶而非Nhe的組件(圖6)[12]。之后通過對nhe操縱子的測序，鑒定出編碼nheC的第3組基因，經檢測該基因所編碼蛋白為Nhe的組成蛋白(圖6)[43]。Nhe蛋白由NheA、NheB和NheC3種蛋白亞基組成，各蛋白亞基大小分別為41、39和36 kDa。Nhe的3種蛋白亞基基因的表達均由其操縱子啟動區的Plc R-box進行調控[44]。Nhe的3種亞蛋白均由Sec系統分泌，且在分泌過程中各蛋白互不干擾，各自獨立分泌至細胞外[45]。

Nhe亞蛋白釋放到菌體外后NheB與NheC進行組裝形成寡聚體，在NheC單體誘導下，宿主細胞膜表面受體與寡聚體中的NheB結合[46]，隨后NheA與寡聚體結合形成復合體使細胞膜產生孔洞，導致胞內離子外流，最終致使細胞在膠體滲透作用下溶解死亡，如圖7[12,26]。Nhe對多種細胞均存在細胞毒性，作用于不同細胞時所表現的毒性也不一致。Nhe的毒性靶細胞主要為上皮細胞，有研究表明其對腎上皮細胞與腸上皮細胞的IC50分別為4.7與10.8 ng/mL[47]。另有研究顯示，當NheA、NheB和NheC的摩爾比為10:10:1時Nhe對Vero細胞的毒性作用達到最大，且當NheC過量時，會對Nhe的毒性產生抑制[48]。與NheC不同，NheB對毒素的毒力有著至關重要的作用，當加入特異性抗體等可以與NheB進行結合的物質后，Nhe的細胞毒性幾乎完全消失[48]。NheA的細胞毒性作用不強，但其對細胞活性存在一定的影響，該亞基的具體作用有待于進一步研究。

2.3 細胞毒素K

CytK是一種單體蛋白，大小為34 kDa，具有細胞毒性、溶血活性、可使皮膚發生壞死。

CytK屬β致孔毒素家族，該家族內毒素均為水溶性單體，在作用于細胞時將自身的成孔區插入細胞膜致使跨膜孔的形成。與其位于同一家族的毒素包括產氣莢膜梭菌的β-毒素[49]、金黃色葡萄球菌的α-溶血素[50]及蠟樣芽胞桿菌的HlyII等。在1998年法國療養院發生嚴重食源性中毒的蠟樣芽胞桿菌NVH 391/98菌體內CytK首次被分離[51]，該菌會引起嚴重腹瀉，并具有致死性。該毒素蛋白由cytK基因進行編碼，在PlcR的調控下進行表達。與Hbl、Nhe相同，CytK的氨基酸序列內也含有分泌信號肽，這表明該毒素同樣由Sec系統進行分泌[52]，此外，該毒素的毒性作用與Hbl、Nhe相類似。

2004年，CytK的變異體CytK-2于NVH 1230/88菌株內被分離。對兩種毒素蛋白進行分析，二者的差異主要集中于蛋白的特定區域內，繼而表明毒素基因表達水平決定其對細胞的毒性作用強弱[53]。目前對與CytK的研究較少，該蛋白在作用于細胞時會對細胞膜進行打孔，繼而使磷脂雙分子層對鉀離子具有透過性，同時細胞外液流入細胞，最終導致細胞發生死亡，如圖8[27]。

2.4 腸毒素II

腸毒素II(HlyII)為蠟樣芽胞桿菌的毒素之一，田萬帆等[54]調查顯示該毒力基因在致病性蠟樣芽胞桿菌中的檢出率為29%。HlyII對人類細胞系具有溶血性和細胞毒性，單獨存在時不具有致腹瀉作用，但其與CytK共同作用時可加強腹瀉程度。該毒素大小為42.3kDa，具有94個氨基酸，與CytK同屬于β致孔毒素家族。對比該家族的其他毒素，HlyII的C-末端延伸并非是形成孔隙或發揮溶血作用的必須之處。該毒素對多種動物的紅細胞有著不同程度的毒性，其與細胞膜的結合為非特異性，即細胞膜上無需具備HlyII的特異性受體，如圖8[27,55]。HlyII不受PlcR調控而是由轉錄調節因子HlyIIR對其進行負調控，直接編碼在HlyII下游[56]。HlyII的啟動子內含有與轉錄起始位點重疊的鐵攝取調節因子(Fur)結合位點，在環境中鐵含量發生改變時通過對該基因的抑制或刺激來維持細菌生長中所需鐵量[26]。

除上述幾種主要的腸毒素外，蠟樣芽胞桿菌還具有腸毒素T(BceT)、腸毒素FM(entFM)、InhA2、溶血素(溶血素O、溶血素II、溶血素III)和降解酶(3個磷脂酶C)等幾類可致腹瀉的毒素。但因其毒性作用不明顯，故對上述毒素研究較少，具體作用效果及作用機制有待于進一步的研究。針對腸毒素的檢測早在90年代就有基于Nhey與Hbl抗體的檢測試劑盒、檢測Hbl的L2的BCET-RPLA試劑盒以及ELISA。現階段針對于腸毒素的檢測主要為普通PCR、多重PCR的定性檢測及熒光定量PCR的定量檢測[57]。

2.5 腸毒素產生的調節

蠟樣芽胞桿菌毒素的毒力水平不僅取決于毒力基因，還取決于菌體所處外界環境。在環境惡劣，營養匱乏之時菌體會選擇性的限制合成與運輸過程中能量消耗過高的毒素的生成，以此來維持菌體的生存[58]。此外，菌體的生長溫度對毒素的產生也具有很大的影響，但其作用機制尚不明確。細菌毒力因子的表達通常是幾種因子協調作用的結果，因此毒力蛋白的合成除編碼蛋白的決定因子外，通常還需額外基因進行調節。蠟樣芽胞桿菌的多數毒力蛋白的表達均由轉錄激活劑PlcR參與調控[59]。此外，蠟樣芽胞桿菌各毒素的合成水平及合成階段具有明顯的差異性，Nhe在指數期分泌量最高，而Hbl則在穩定期含量最高，由此可見毒素的合成是由多種因素共同調控完成的。

3 蠟樣芽胞桿菌病的防控

蠟樣芽胞桿菌廣泛存在于土壤、空氣和水體環境中，因此該菌不可避免地會污染食品[60]。研究表明，當食物中蠟樣芽胞桿菌的檢出量為1×102CFU/g就能夠引發食物中毒，這類被污染的食物往往并未引起感官變化，但是可以使宿主致病[61]。夏季氣溫更接近蠟樣芽胞桿菌的最適生長溫度，食物容易腐敗變質，因而夏季是該菌引發食物中毒的高發期。減少蠟樣芽胞桿菌中毒的關鍵是要避免該菌在食物中大量生長和產生毒素，可從以下幾個方面進行預防。

3.1 日常食品的處理

大米、腐乳和乳制品等均可以被蠟樣芽胞桿菌污染，因此在食品原材料加工階段要嚴格控制蠟樣芽胞桿菌的含量。在烹飪時需要注意食物的加熱溫度和加熱時間，烹飪后的食物如果不立即食用，應冷藏處理，避免蠟樣芽胞桿菌的生長繁殖。蛋白質豐富的食物與米飯、面條、包子等淀粉含量高的食物放在一起會加快蠟樣芽胞桿菌生長，所以這些食物要分開存放。蠟樣芽胞桿菌污染飼料導致動物中毒的事件也屢有發生，嚴重威脅到動物養殖和食品安全。因此須開發更高效、低廉的微生態制劑監控與檢測該菌的含量，以阻斷蠟樣芽胞桿菌及其毒素對動物健康的威脅。

3.2 注意環境衛生

蠟樣芽胞桿菌無處不在，因而食品加工所用的儀器設備要經常清洗，避免污染。加工車間不應有昆蟲、老鼠以及雜物出現，維持地面清潔，以免造成蠟樣芽胞桿菌的殘留和二次污染。

3.3 選擇合適的消毒劑

清潔完成之后要使用消毒劑對儀器設備進行消毒。最常用的消毒劑是濃度為75%的酒精，但其卻不能殺滅產芽胞的細菌。過氧乙酸可以殺滅真菌、細菌、芽胞以及病毒，但其具有腐蝕性和易揮發性，使用時需現用現配。

4 總結與展望

近年來隨著抗生素等藥物的濫用和亂用，有毒蠟樣芽胞桿菌的侵襲力也在不斷的發生變化。Veysseyre等[62]對一所醫院5年內確診為感染蠟樣芽胞桿菌患者的臨床癥狀進行統計，結果顯示29.8%的患者發生單純菌血癥，28.1%的患者發生皮膚感染，17.5%的患者發生骨及關節感染，11.8%的患者發生死亡，54.4%的患者在內科進行治療。該細菌所針對的靶器官從最初的胃腸道擴展到其它臟器，甚至可使宿主死亡，可見蠟樣芽胞桿菌的侵染能力逐漸增強。此外，該菌對動物的侵襲力也在逐步增強，其宿主的種類也在逐漸增多，有研究顯示，豬、馬、鼠、牛、鱉、鴿子及家蠶等均為該菌的易感動物[15,41,55,63-65]。

蠟樣芽胞桿菌與金黃色葡萄球菌腸毒素引起的中毒癥狀十分相似，因此，蠟樣芽胞桿菌所導致中毒事件常常被忽視。長期濫用抗生素致使耐藥基因的出現，大大增加了感染的幾率。在國內將其作為益生菌使用過程中，雖然在安全性有一定的評估和監督，但還是有一定的疏漏，因此作為益生菌使用前應進行全面檢測，以確定菌株的安全性。蠟樣芽胞桿菌的毒力因子與細菌致病性的強弱相關聯，隨著對該菌各種毒素的深入研究，越來越多的研究顯示，蠟樣芽胞桿菌的毒素不僅具有細胞活性，很多毒素還對宿主機體的免疫系統等方面產生影響。此外，該菌所分泌的毒素不易通過普通手段進行去除。因此，可暫時通過對菌體的防控來實現對該菌及毒素所致疾病的預防，同時有必要開展相關調查，以增加對蠟樣芽胞桿菌菌株毒素的研究，進一步對疾病預防提出有效措施。