維吾爾藥材睡蓮花的質量標準研究

趙榮梅 艾買提江·阿衣甫別克 徐 鴻 于新蘭 馬國明

新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院 中藥(維藥)質量控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054

睡蓮花是睡蓮科睡蓮屬植物雪白睡蓮(Nymphaeacandida)的干燥花蕾，該植物生在池沼中，分布廣泛，主產于新疆伊犁、阿勒泰和博湖地區，西伯利亞、中亞、歐洲也有分布[1]。維吾爾醫認為睡蓮花性質二級濕寒，具有降熱止渴、益心護腦、祛乃孜來等功效，用于感冒發熱、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等[2-3]。文獻[4-10]報道,睡蓮花含有黃芪苷、煙花苷、紫云英苷、槲皮素3-O-木糖苷、槲皮素、槲皮素3′-O-β-D-吡喃木糖苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、蘆丁等化學成分。

睡蓮花作為維吾爾醫的常用藥材，在祖卡木顆粒、炎消迪娜兒糖漿、降熱比那甫西糖漿等成藥的處方中均有使用。現行質量標準現收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》維吾爾藥分冊中[3]，內容只有性狀、粉末顯微鑒別等項目。質量標準不完善導致企業無法全面控制藥材質量。本研究的目的在于對其質量標準進行系統研究，保證用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BX-51型生物顯微照相系統(OLYMPUS)；CAMAG TLC Visualizer型薄層色譜成像系統(瑞士卡瑪)；KUDOS SK7210LHC型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4全自動點樣儀；高效液相色譜儀(Agilent 1260型，DAD檢測器；島津LC-2010型，VWD檢測器；Thermo Ulltimate 3000型；紫外檢測器)；MS 204S型電子天平(Mettler toledo)；XT-1000A 型高速多功能粉碎機(浙江永康市紅太陽機電有限公司)。

1.2 材料 山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品(批號：112007-201602，含量：90.8%，中國食品藥品檢定研究院)，硅膠G薄層預制板(批號：20200430，煙臺市化學工業研究所)；甲醇、乙腈為色譜級(Thermo Fisher)，其他試劑均為分析純。

睡蓮花藥材購自于新疆不同地區民族藥材市場和民族醫院，共19批次(產地為新疆的樣品批號為：yfb1712004、yfb1712005、yfb1712006、Y1711021、H30134102、SLH-YP-170830、20170903；產地為巴基斯坦的樣品批號為：20170905、1706018、170422；產地為河北白洋淀的樣品批號為：yfb1712001、yfb1712002、yfb1712003、yfb1712007、yfb1712008、yfb1712009、Y1709009；產地為云南的樣品批號為:201608；產地為成都的樣品批號為：20170904)。由新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院蘇來曼·哈力克教授鑒定為睡蓮科睡蓮屬雪白睡蓮Nymphaeacandida。

2 方法與結果

2.1 性狀 本品呈圓錐形或長圓形，多皺縮破碎?；ɡ匍L2.5～4.5 cm，直徑約2 cm，花托略呈方形。殘留花梗，有縱棱，表面被短絨毛?；ㄝ?，革質，近離生，長卵狀披針形，無毛，表面綠色或黃棕色。剝去花萼可見白色或黃白色花瓣。雄蕊多數，花藥線形，花絲扁平，幾與花藥等長。子房球形或橢圓形，無花柱或極短，柱頭密排成輪狀，中部有凹陷。氣微，味淡。如圖1所示。

圖1 生態和性狀特征圖

2.2 顯微鑒別 分別取藥材細粉適量，置載玻片上，加水合氯醛溶液透化后，置顯微鏡下觀察，拍照記錄。如圖2所示。結果可見：腺毛頭部類圓形，由1～3細胞組成。非腺毛海星狀，或碎斷，基部細胞類方形，表面附有大量草酸鈣方晶。花粉粒類圓形，直徑30～60 μm。薄壁細胞中可見大量草酸鈣結晶(砂晶、方晶或簇晶)。

草酸鈣方晶;海星狀非腺毛;花粉粒類圓形;腺毛圖2 顯微特征圖

2.3 TLC鑒別 取本品粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過，作為供試品溶液。另取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，加甲醇制成1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。如圖3所示。

2.4 水分測定 按照《中國藥典》2020年版四部通則“0832第二法”測定水分。見表1。

2.5 總灰分和酸不溶性灰分測定 按照《中國藥典》2020年版四部通則“2302灰分測定法”測定。見表1。

2.6 浸出物測定 按照《中國藥典》2020年版四部通則“2201浸出物測定法”測定，以水和不同濃度的乙醇為溶劑，采用熱浸法和冷浸法分別測定浸出物含量，確定提取方式為以70%乙醇溶液為溶劑，采用熱浸法測定醇溶性浸出物含量。見表1。

2.7 含量測定方法的建立

2.7.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表2中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為350 nm，流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL。理論板數按山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰計算應不低于 4000。

表2 色譜條件

2.7.2 對照品溶液的制備 取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每1 mL含24 μg的溶液，即可。

2.7.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.7.4 系統適用性試驗

2.7.4.1 線性關系的考察 精密量取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品溶液(51.07 μg/mL)1、2、3、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋制成系列標準溶液，按“2.7.1”色譜條件測定，以對照品溶液濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：A=16.936×C+1.7465(r=0.9999)。結果表明，山柰酚-3-O-蕓香糖苷濃度在5.11～51.07 μg/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系。

2.7.4.2 重復性試驗 取同一批號供試品(批號：SLH-YP-170830)，按照“2.7.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.7.1”項下色譜條件進樣分析，測定山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量。以6次測定結果計算RSD值，結果山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量的RSD值為1.76%(n=6)，表明本方法的重復性良好。

2.7.4.3 穩定性試驗 取同一批號供試品溶液(批號：SLH-YP-170830)，分別于0、2、4、6、8、12、14、18、24和32 h進樣分析，測定山柰酚-3-O-蕓香糖苷的峰面積。以10次測定的峰面積值計算RSD值，結果山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD值為0.32%。表明供試品溶液在室溫放置32 h內穩定性良好。

2.7.4.4 精密度試驗 取同一批號供試品溶液(批號：SLH-YP-170830)，按照“2.7.1”項下色譜條件連續進樣6次，以6次峰面積值計算RSD值。結果山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD值為0.28%，表明本方法精密度良好。

2.7.4.5 回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品(批號：SLH-YP-170830)0.1 g，9份，分別置于置具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液適量，按照“2.7.3”項下方法制備得到高、中、低濃度的加標溶液。按照“2.7.1”色譜條件進樣分析，計算山柰酚-3-O-蕓香糖苷回收率。結果見表3。

表3 回收率試驗數據 (n=9)

2.7.4.6 靈敏度 當S/N為3時，溶液濃度為檢出限，即為0.145 μg/mL，RSD為1.9%；當S/N為10時，溶液濃度為定量限，即為1.146 μg/mL，RSD為 1.8%。

2.7.5 供試品的測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照“2.7.1”色譜條件測定，即得，按干燥品以外標法計算含量。如圖4所示及表4。

A.對照品溶液色譜圖 B.供試品溶液色譜圖圖4 HPLC色譜圖

表4 樣品含量測定數據

3 討論

3.1 含量測定方法的考察 在考察樣品前處理方法時，采用50%、70%、100%的甲醇和乙醇溶液作為提取溶劑，以1∶100、1∶125、1∶250、1∶500 作為料理比，超聲時間分別為15、20、25和30 min提取，對同一批次睡蓮花樣品中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量進行測定，選擇含量最高的提取方式為70%乙醇溶液為溶劑，超聲功率為250 W，超聲時間為30 min。在考察方法耐用性時，分別考察了不同品牌高效液相色譜儀、不同品牌及批號的同類型色譜柱、儀器流速、儀器柱溫對含量測定結果的影響。實驗結果表明，這些影響因素均未對測定結果有明顯的影響。

3.2 檢驗項目限度的初步探索 本研究收集的樣品具有代表性，水分含量為8.12%～10.39%，平均值為9.35%；總灰分含量為8.22%～11.76%，平均值為9.83%；酸不溶性灰分為0.11%～2.30%，平均值為1.18%；浸出物含量為31.47%～40.79%，平均含量為35.63%。與藥材生長環境、產地的大陸性氣候、炮制等相結合，擬定藥材水分限度為不得過 12.0%；總灰分限度為不得過12.0%；酸不溶性灰分限度為不得過2.0%；浸出物含量限度為不得低于30.0%。山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量(%)為0.22% ± 0.035%(n=19)，按照國家藥典委員會中藥質量標準研究制定技術要求，按其平均值的±20%作為限度的制定幅度，以干燥品來計算含量，擬定含量限度為不得少于0.17%，并列入該品種質量標準草案正文內容。

《中國植物志》中記載標準規定的雪白睡蓮在國內產于新疆，本課題組在收集樣品時發現我國云南、成都、河北等地也生長雪白睡蓮。因此，本課題組將這些產地的雪白睡蓮也納入研究范圍，通過數據分析得知，河北白洋淀產的水分、總灰分和酸不溶性灰分含量最高，新疆和巴基斯坦進口的次之，成都和云南產的最低；但成都和云南產的浸出物和煙花苷含量最高，新疆和巴基斯坦進口的次之，河北白洋淀產的最低。此次對睡蓮花藥材進行了系統研究，修訂了質量標準，該標準較全面反應睡蓮花藥材的質量。通過此次對雪白睡蓮花的初步探索，對藥材流通和質量監管方面具有一定的意義。