大孔樹脂純化細氈毛忍冬中總黃酮工藝研究

鄭光雅

四川省監獄管理局中心醫院，四川 成都 610000

細氈毛忍冬LonicerasimilesHemsl(圖1、圖2)為西南地區金銀花的主流品種[1]，該種資源豐富，使用歷史悠久。大量研究表明，金銀花及其同屬植物的化學成分以有機酸、黃酮類、皂苷類成分為主，但細氈毛忍冬相關研究鮮見報道。近年來國內外新發展的分離技術大孔吸附樹脂在醫藥領域特別是天然藥物精制中廣泛應用，是提取分離中草藥有效成分的一種有效方法[2-3]。本文以細氈毛忍冬提取物為研究對象，采用大孔樹脂對其黃酮類成分進行分離、純化研究，為細氈毛忍冬化學成分的進一步深入研究奠定基礎。

圖1 細氈毛忍冬原植物

圖2 細氈毛忍冬干藥材圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 旋轉蒸發儀RE-5203(上海亞榮生化儀器廠)；紫外-可見分光光度計UV1100(上海天美科技有限公司)；電子天平TD6001(天津天與儀器廠)；大孔樹脂D101(天津市光復精細化工研究所)。

1.2 材料 蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢驗所)；大孔樹脂D101、DM301、DA201、AB-8(均為天津農藥股份有限公司樹脂分公司)，LD605(為晨光化工研究院)；乙醇、亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉等均為分析純。

細氈毛忍冬藥材采購于四川省南江縣，經成都中醫藥大學馬逾英教授鑒定為忍冬科植物細氈毛忍冬LonicerasimilisHemsl。

2 方法與結果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品約25 mg，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻。精密量取20 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取細氈毛忍冬干燥花蕾475 g，采用文獻[4-5]方法進行提取得浸膏。精密稱取浸膏0.5 g，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標準曲線的建立 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色。再加水定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法[6]，于510 nm波長處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程：A=0.0137C+0.0008，r=0.9999，n=6。線性范圍：8.0179～48.1074 μg/mL。

2.1.4 細氈毛忍冬提取物中總黃酮的測定 取供試品溶液適量，參照2.1.3中方法測定其吸光度，代入標準曲線，計算出總黃酮的含量。

2.2 篩選不同型號大孔吸附樹脂的研究

2.2.1 大孔樹脂的預處理 試驗用5種大孔樹脂(D101、DM301、DA201、AB-8、LD605)用體積分數95%的乙醇浸泡24 h，再用蒸餾水反復洗滌6～8次，至無乙醇味，然后用5%HC1溶液浸泡8 h，用蒸餾水洗至中性，再用5%的NaOH溶液浸泡8 h，用蒸餾水洗至中性，備用。

2.2.2 不同類型大孔樹脂吸附性能的考察 量取各種類型的大孔樹脂(干重約為1 g)置150 mL的具塞錐形瓶中，分別精密加入細氈毛忍冬供試品溶液90 mL，靜置24 h，時時振搖，使其充分吸附后，過濾，按照2.1.3中的方法測定濾液中剩余總黃酮的含量，計算吸附量；將吸附平衡后的大孔樹脂轉移至錐形瓶中，用95%乙醇解吸，測定解吸液中總黃酮的含量，計算解析率；結果見表1、圖3。

圖3 不同類型大孔樹脂靜態吸附性能分析圖

表1 各型樹脂對細氈毛忍冬總黃酮的吸附率和解吸率

吸附量=上柱液中總黃酮含量(mg)-泄漏液中總黃酮含量(mg)

吸附率=[吸附量(mg)/上柱液中總黃酮含量(mg)]×100%

解吸率(%)=[解吸液中總黃酮含量(mg)/吸附量(mg)]×100%

結果表明：通過對五種不同的大孔樹脂進行考察，發現 LD605 吸附能力最強，但是很難被解吸下來；D101大孔樹脂在所給的實驗條件下對總黃酮吸附有較大的吸附量，而且能夠把絕大部分解吸下來。故選擇D101大孔樹脂純化細氈毛忍冬提取物。

2.3 D101大孔樹脂純化細氈毛忍冬中總黃酮的的工藝參數考察

2.3.1 上柱液濃度對總黃酮含量的影響 稱取一定量的細氈毛忍冬浸膏，分別稀釋成不同濃度，通過裝有D101大孔樹脂(干重約4g)的吸咐柱中，以2～3 mL/min 流速進行吸附，收集流出液，測定總黃酮的含量，計算大孔樹脂的比吸附量，結果見表2、圖4。

圖4 上樣液濃度考察結果圖

表2 上樣液濃度考察

比吸附量=吸附量(mg)/樹脂干重(g)

結果表明:上柱液生藥濃度為0.10 g/mL時，D101大孔樹脂對細氈毛忍冬總黃酮的比吸附量最大，為97.55 mg/g，因此選擇上柱液生藥濃度為0.10 g/mL。

2.3.2 比上柱量對總黃酮含量的影響 將180 mL的細氈毛忍冬提取液通過D101大孔樹脂(干重約4 g)，上柱分離純化，分段收集流出液，每份10 mL。測定流出液中總黃酮的含量，計算出其泄漏百分率，結果見表3、圖5。

圖5 吸附泄漏曲線圖

表3 比上柱量的考察

續表 表3 比上柱量的考察

比上樣量=生藥量(g)/樹脂干重(g)

結果表明：上樣至第14份時泄漏的細氈毛忍冬總黃酮開始顯著增大，說明樹脂柱開始不能完全吸附藥液中的總黃酮。為了細氈毛忍冬總黃酮保留完全，將最大上樣量80%的量即110 mL作為上樣量，以總黃酮在藥材含量為3.39%計，得到樹脂的比上柱量為2.74 g/g(藥材/干樹脂)。

3 結論

大孔吸附樹脂為一種有機高聚吸附劑，具有選擇性好、吸附容量大、解吸容易、再生簡便等優點，對苷類、黃酮類等成分的富集純化有較好的效果，在生物堿類、酚類等方面的分離純化中也有廣泛應用[7]。鑒于細氈毛忍冬的有效成分有黃酮類和皂苷類成分，本研究采用大孔樹脂對細氈毛忍冬的提取物進行分離純化。大孔樹脂法技術條件要求較高，本實驗以靜態吸附量及解析率篩選樹脂類型，在動態吸附條件上，研究影響純化的工藝參數如上樣液濃度、比上柱量等，最終確定了大孔樹脂純化細氈毛忍冬提取物的工藝為：D101大孔樹脂純化細氈毛忍冬提取物，上柱藥液生藥濃度為0.10 g/mL，比上柱量2.74 g/g(藥材/干樹脂)上柱吸附。本法簡單，成本較低，且能達到較好的分離純化效果，該法可用于擴大生產，為下一步深入研究細氈毛忍冬中黃酮類化合物奠定了基礎。