傣藥紅花臭牡丹根飲片質量標準研究

陸應彩 彭 霞 李 清 卯明霞 仁紹坤

西雙版納州食品藥品檢驗所，云南 景洪 666100

紅花臭牡丹根飲片為馬鞭草科植物赪桐Clerodendrumjaponicum(Thunb.)Sweet的干燥根的加工炮制品。紅花臭牡丹根的藥材標準收載于《云南省中藥材標準》2005年版第三冊[1]，西雙版納地區傣醫將紅花臭牡丹根稱為“哈賓亮”，意譯為“療效顯著，名貴價高”[2-5]，傣醫是四大民族醫藥之一，紅花臭牡丹根、葉均作藥用，為傣醫常用藥，具有清火解毒、活血止血、調經通乳、除風止痛、補土健胃的功效，用于治療月經不調、痛經、赤白帶下、產后缺乳；六淋證出現的小便熱澀疼痛、尿黃、尿血；睪丸腫痛；脘腹脹痛，不思飲食，四肢乏力；風濕病關節肌肉腫痛[2-5]。預實驗及文獻報道[6-7]表明，紅花臭牡丹根主要含有鞣質、酚酸類、黃酮類及揮發油等成分。近代藥理研究發現黃酮類化合物具有神經保護、抗心肌缺血、抗胃潰瘍、抗炎、抗腫瘤以及降糖等藥理作用[8-11]。而目前尚無紅花臭牡丹根飲片質量標準的研究[1-2]。故本文建立紅花臭牡丹根飲片質量標準[12]，且參照《赪桐根中總黃酮的提取工藝》[7]及《腎茶總黃酮的含量測定》[13]采用蘆丁為對照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后，用紫外分光光度法對紅花臭牡丹根飲片中總黃酮的含量進行研究以有效控制其質量并為其應用提供保障。紅花臭牡丹植物圖如圖1。

(a)生境圖

(b)生境圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2600紫外分光光度計(島津)；BGZ-76電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)；SX2-4-10箱式電阻爐；TLCVisualizer2薄層色譜成像儀(瑞士卡瑪)；OLYMPUS BX41生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)；BL310天平(德國賽多利斯集團)；AE200電子天平[梅特勒-托里多儀器(上海)有限公司,型號：MS205DU]；LC-300B數控超聲波清洗器(濟南市中區魯超儀器廠)；UPH-IV-20T超出水機(四川優普超純科技有限公司)；DFT-100A高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)；CAMAG Linomat 5半自動薄層點樣儀(瑞士卡瑪)；TLC Visualizer 2薄層色譜成像儀(瑞士卡瑪)；RE-20000A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SPS-04L氣相色譜儀(安捷倫科技)。

1.2 試藥 不同產地的10批藥材分別采自云南景洪市、云南勐海縣、云南勐臘縣。由西雙版納州食品藥品檢驗所彭霞主任藥師鑒定為馬鞭草科植物臭茉莉ClerodendrumphilippinumSchau. var. simplex C. Y. Wu et R. C. Fang。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610，含量UV法測定，以92.6%計)。無水乙醇(分析純)、氫氧化鈉(優級純)、亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純)、石油醚(分析純)、丙酮(分析純)、鹽酸(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、硫酸(分析純)、二氯化鉀、水合氯醛等均為天津市風船化學試劑科技有限公司生產，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 性狀 本品為大小不一的類圓形及不規則塊片，厚0.2～1.0 cm。外表面灰棕色至黃棕色，具不規則細皺紋，有少數凸起的支根痕。質硬，切面皮部較薄，木部寬廣，黃白色，有橫向裂紋，有的莖木髓部中空。氣微，味淡。如圖2所示。

圖2 紅花臭牡丹根飲片圖

2.2 顯微特征 粉末淡黃色。木栓細胞黃棕色，類長方形或類多角形，壁不甚厚；韌皮纖維多單個散在，長梭形，壁厚，孔溝明顯，直徑約為17～19 μm；木纖維成束，孔溝不明顯，直徑約為16～17 μm。導管為具緣紋孔，紋孔排列緊密，直徑約為43～59 μm；石細胞眾多，呈類方形、類長方形或類三角形，單個散在或集聚成群，壁厚，孔溝明顯，胞腔內大多含草酸鈣方晶，直徑25～50 μm。淀粉粒眾多，大小不一，多單粒，呈類圓形或類橢圓形，臍點十字形、裂縫狀、點狀，直徑4～12 μm；復粒多由2～4分粒組成。草酸鈣方晶直徑11～22 μm。《云南省中藥材標準》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根”項下，未入標準。如圖3所示。

2.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末 1 g，加乙醇 15 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取紅花臭牡丹根對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》四部通則0502)[14]試驗，吸取上述兩種溶液各 10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)- 丙酮(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

《云南省中藥材標準》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根”項下有薄層色譜鑒別一項。已納入標準。按照藥材薄層色譜條件，檢測三個不同產地10批紅花臭牡丹根飲片，薄層色譜圖均一致，重現性好，符合規定，納入標準。如圖4所示。

2.4 檢查項與浸出物 參照《云南省中藥材標準》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根藥材”項下的規定及《中國藥典》(2015版四部通則)[14]測定三個不同產地10批紅花臭牡丹根飲片樣品的水分(通則0832第二法)、總灰分(通則2302)、酸不溶性灰分(通則2302)、砷鹽(通則0822第一法)，重金屬(通則0821第二法)、有機氯農藥殘留量(通則2341，測定9種有機氯農藥殘留量)總六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、總滴滴涕(p,p＇-DDE、p,p＇-DDD、o,p＇-DDT、p,p＇-DDT之和)、五氯硝基苯；浸出物(通則2201用水作溶劑照水溶性浸出物測定法項下的熱浸法)。各項測定結果均符合規定，結果均見表1。

表1 各項測定結果及限度 (n=2)

2.5 總黃酮的的含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，置 100 mL 量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取 20 mL，置 50 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每 1 mL 中含蘆丁 0.3 mg)。

2.5.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL，分別置于 25 mL 量瓶中，各加水至 6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加10%硝酸鋁溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加氫氧化鈉試液 10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置 15 min，以相應試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)[14]，在 357 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.5.3 測定法 取本品粉末約 0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%乙醇溶液 100 mL，稱定重量，置 85 ℃ 水浴上回流 1 h，放至室溫，稱定重量，用80%乙醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液 10 mL，置 25 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取 5 mL，置 25 mL 量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加水至 6 mL”起依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量。按干燥品計算，含總黃酮以蘆丁(C27H30O16)計算。

2.5.4 吸收光譜的測定、光譜一致性檢測 精密吸取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各 5 mL，分別置于 25 mL 量瓶中，照分光光度法，在200～800 nm 波長范圍內測定吸收光譜，結果蘆丁對照品與供試品光譜吸收圖譜基本一致，在 357 nm 處有最大吸收。參照赪桐根中總黃酮的提取工藝優選[7]及腎茶中總黃酮的含量測定方法[2]，選取 357 nm 為檢測波長。

2.5.5 線性關系考察 精密量取蘆丁對照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL(相當于蘆丁2.86282、5.72567、8.58846、11.45129、22.90257、34.35386、45.80515、57.25643、68.70772 μg/mL)，按上述測定法測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程：Y=0.0287528X+0.00831103，r2=0.99985，結果表明蘆丁在2～68 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5.6 精密度試驗 取同一批樣品6份(產地：西雙版納景洪市曼蚌湯，批號：20190702)，按供試品測定方法測定，總黃酮的平均含量為5.32%，RSD為1.5%。

2.5.7 重復性試驗 精密量取2.5.1對照品溶液(22.90257 μg/mL)，按“2.3”項下方法操作，依次測定7次，以吸收度值計算RSD為0.16%，結果符合要求。

2.5.8 加樣回收率試驗 根據《中國藥典》2015版四部(通則9101)[14]，藥品質量標準分析方法驗證指導原則中準確度相關規定，設計同一濃度，9份供試品溶液按2.5.3方法進行測定。該分析方法的回收率為101.17%～107.89.20%，且RSD為2.4%，結果符合要求。

2.5.9 樣品測定 取不同產地的10批紅花臭牡丹根飲片，按照上述方法制備供試品溶液，按2.5.2確定工作曲線，以干燥品計算總黃酮含量。測定結果均符合規定，結果見表1。

3 討論

3.1 試驗條件的考察

3.1.1 含量測定試驗 以蘆丁為對照品采用分光光度法，以相應的試劑為空白，分別考察溶劑: 50% 乙醇、60%乙醇、70% 乙醇、80%乙醇；提取方式: 回流提取時間分別為60 min、90 min、120 min; 回流溫度分別為75 ℃、85 ℃、95 ℃ ； 超聲處理分別為30 min、45 min、60 min；溶劑量分別為25 mL、50 mL、100 mL；取樣量分別為0.25 g、0.5 g、1.0 g、1.5 g制備的供試品溶液，在357 nm 波長處測定吸光度，計算總黃酮的含量。結果表明，取樣量為0.25 g，100 mL 80%乙醇為溶劑85 ℃回流提取，紅花臭牡丹根中總黃酮的溶出量最大，因此選取此方法制備供試品溶液。穩定性試驗結果表明供試品溶液在30分鐘內穩定性良好。

3.1.2 薄層色譜鑒別 本次飲片研究考察了薄層色譜的耐用性。不同廠牌的薄層板，硅膠G薄層板(青島海洋化工廠、青島譜科分離材料有限公司、青島勝海精細硅膠化工有限公司)；其它的方法驗證《云南省中藥材標準》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]已收載。

3.2 限度擬定 各項限度是根據各測定結果照《云南省中藥材標準》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根藥材”項下的限度擬定標準進行擬定，具體見表1。鑒于砷鹽均符合規定暫不納入標準，重金屬均小于百萬分之十暫不納入標準，有機氯農藥殘留量中總六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、總滴滴涕(p,p＇-DDE、p,p＇-DDD、o,p＇-DDT、p,p＇-DDT之和)、五氯硝基苯均未檢出故不納入標準。