單面針藥材真偽鑒別研究及等級評價體系的初步建立

凌勇根，王月秀，冷其霖，劉 洋，譚喜平，龔 云，龔力民，林麗美，張 鵬*

（1.株洲千金藥業股份有限公司，湖南 株洲 412007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

單面針又名山枇杷、大葉花椒、蜆殼花椒等[1]，為我國南方重要的珍稀木本藥用植物資源[2]，主產于我國西南及湖南、湖北、廣東、廣西等地[3]。 其主要含有多種生物堿[4-5]、內酯類[6]和黃酮類[7]等化學成分，具有活血散瘀、祛風除濕、理氣止痛的功效。單面針為蕓香科植物蜆殼花椒（Zanthoxylum dissitum Hemsley）或刺殼花椒（Zanthoxylum echinocarpum Hemsley）的干燥根和莖[8]。 同屬植物兩面針為蕓香科植物兩面針[Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.]的干燥根，具有活血化瘀、行氣止痛、祛風通絡、解毒消腫功效，用于治療跌打損傷、胃痛、牙痛等[9]，兩者的化學成分的相似，混用現象較常見，市場上常見的偽品還有野生花椒等，上述混偽品嚴重影響了單面針藥材的安全應用和質量保障。

“辨狀論質”作為中藥品種傳統經驗鑒別，最早由我國著名中藥學家謝宗萬教授概括提出[10]，即通過“辨狀”，包括藥材的形狀、大小、色澤、表面特征、質地、 斷面特征及氣味等來辨別藥材的真偽和評判藥材的優劣，即“論質”。 也有報道以性狀特征[11]、紅外光譜[12]、分子生物學[13]和質譜技術[14]等進行區分，但關于系統地薄層色譜法和高效液相色譜法卻少有報道。 本研究采用薄層色譜法和高效液相色譜法系統地比較分析，旨在找到單面針與兩面針及混偽品的明顯區分點，為單面針真偽鑒別和質量控制提供參考。

《七十六種藥材商品規格標準》[15]作為中藥材分級的國家標準，執行至今已有35 年，但單面針藥材一直未被收錄，本研究收集30 批單面針藥材，通過對不同批藥材的性狀、雜質、直徑、水分、灰分、二氧化硫殘留量、重金屬和有害元素殘留量、醇溶性浸出物及木蘭花堿含量進行檢測和分析，采用SPSS 19.0統計軟件分析單面針藥材等級與各質控指標之間的相關性，建立了初步的等級評價體系，為優質的單面針藥材質量控制提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ATS 4 薄層色譜全自動點樣儀、ADC 2 薄層色譜全自動展開儀、Derivatizer 薄層色譜全自動噴霧系統、Visualizer 2 薄層色譜數碼成像系統（瑞士CAMAG 公司）；TH-II 薄層色譜顯色加熱器 （上海科哲生化科技有限公司）；Waters e2695 型高效液相色譜儀、Waters 2998 型PDA 檢測器（美國Waters 公司）；iCAP RQ ICP-MS 電感耦合等離子體質譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；AB204-S 型電子天平、AB135-S 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SM100 型切割室研磨儀[弗爾德（上海）儀器設備有限公司]；114B 型搖擺式中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；A11 型分析型研磨儀（德國IKA 公司）；DZAKW-D-6 型恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）；SX2-4-10 型系列箱式電阻爐（上海力辰儀器科技有限公司）。

1.2 試藥

木蘭花堿對照品（批號：M-026-180524）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；氯化兩面針堿（110848-201604）購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇（批號：P1441123）、95%乙醇（批號：P1433419）、三氯甲烷（批號：P1318320）、乙醇（批號：P1437228）、乙酸乙酯（批號：P1429095）、氨水（批號：P1375833）、二氯甲烷（批號：P1454839）、二乙胺（批號：P1382819）均為分析純，購于General-Reagent 公司；甲醇（批號：P1433419）、甲酸（批號：P1441123）為色譜純，購于General-Reagent 公司。藥材均為株洲千金藥業股份有限公司提供，經由湖南中醫藥大學龔力民教授鑒定，單面針為蕓香科植物蜆殼花椒（Zanthoxylum dissitum Hemsley）或刺殼花椒（Zanthoxylum echinocarpum Hemsley）的莖，兩面針為蕓香科植物兩面針[Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC.]的根，野花椒為蕓香科植物野花椒（Zanthoxylum simulans Hance.）的莖，飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血[Toddalia asiatica(L.)Lam.]的莖。 詳見表1。

表1 實驗樣品信息

2 方法與結果

2.1 薄層色譜法

2.1.1 供試品溶液的制備 取供試品粉末（過二號篩）2 g，置具塞錐形瓶，加乙醇40 mL，密閉，超聲處理60 min，過濾，水浴蒸干，殘渣加2 mL 乙醇溶解即得，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿、氯化兩面針堿對照品適量，分別加乙醇制成1 mL 中含1 mg 和0.5 mg 的對照品溶液。

2.1.3 薄層色譜鑒定 照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0502）[16]試驗，吸取上述對照品溶液5 μL；供試品溶液5～10 μL 分別點于同一硅膠GF254 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水-二乙胺（40∶10∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，在365 nm 下檢視。 供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.4 樣品結果 采用上述色譜法對4 批蜆殼花椒（S1～S4）、3 批刺殼花椒（C1～C3）、4 批兩面針樣品（LS26～LS29）及3 批偽品[1 批飛龍掌血（W1）、2 批野花椒（W2、W3）]進行薄層鑒別，結果樣品中斑點清晰，不同基原樣品具有良好的一致性，在Rf=0.9處，各有兩條亮紅色斑點，可以作為單面針與兩面針及偽品的鑒別點，可以達到區分偽品的目的。薄層圖譜見圖1。

圖1 薄層色譜樣品檢測

2.2 高效液相色譜法[17]

2.2.1 色譜條件與系統適應性 色譜柱為Waters SunFire C18（柱長25 cm，內徑為4.6 mm，粒徑為5 μm），以甲醇為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（表2）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為268 nm。 理論塔板數按木蘭花堿計算應不低于5000。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含木蘭花堿60 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取30 批單面針和15 批兩面針樣品，粉碎，過3 號篩，約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 樣品結果 單面針藥材標志性成分主要為1號峰和2 號峰（木蘭花堿），通過單面針與兩面針色譜圖對比分析，1 號峰可作為區分單面針和兩面針的特征性成分。 30 批單面針圖譜和15 批兩面針圖譜見圖2-4。

圖2 單面針色譜圖

2.3 外觀特征

2.3.1 性狀 按照《湖南省中藥材標準》（2009 年版）[8]規定對30 批單面針藥材進行測定。

本品為類圓形。莖表面灰褐色或暗灰色，有縱向突起的棱紋或皮孔，乳頭狀突起的皮刺或橢圓形的皮刺疤痕。質堅硬，難折斷，切面皮部極窄，木部黃白色或淡棕紅色，可見同心性環紋及密集的射線。髓部白色，迎光可見閃爍的小亮點。 味稍苦而有刺喉感。

2.3.2 直徑樣品測定 取30 批單面針藥材，直徑按照《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部[16]規定進行測定，結果見表3。

表3 30 批單面針外觀特征測定結果

圖3 兩面針色譜圖

圖4 單面針及兩面針液相鑒別區分點

2.3.3 樣品結果 30 批單面針樣品直徑范圍1.1～2.8 cm，變異幅度達到1.7 cm，說明不同產地單面針直徑大小存在一定差異，通過感官可直接分辨大小。

2.4 內在質量

2.4.1 樣品測定 取30 批單面針藥材，雜質、水分、總灰分、醇溶性浸出物、重金屬及有害元素、有機氯農藥殘留、二氧化硫殘留量按照《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部[16]規定進行測定，木蘭花堿含量按照“2.2”項進行測定，結果見表4-6。

表4 30 批單面針水分、總灰分、浸出物、含量測定結果

2.4.2 樣品結果 雜質的含量為1%～3%。水分的含量為7.2%～9.2%，均不超過《湖南省中藥材標準》（2009 年版）中單面針水分規定的限量14.0%。 總灰分的含量為2.3%～3.9%，均不超過《湖南省中藥材標準》（2009 年版）中單面針總灰分規定的限量5.0%。醇溶性浸出物的含量為3.9%～7.0%，平均值5.4%，均符合《湖南省中藥材標準》（2009 年版）中單面針浸出物規定的限量3.0%。重金屬及有害元素中鉛的含量為0.5～3.2 mg/kg、鎘的含量為0.1～0.6 mg/kg、砷的含量為0.04～0.2 mg/kg、汞的含量均未超過0.01 mg/kg、銅的含量為2.2～8.3 mg/kg。 均在中國《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》[18]規定限度內，處于安全水平。總六六六、總滴滴涕、五氯硝基苯均未檢出，故本品未規定有機氯農藥殘留量的限度。 二氧化硫殘留量均未超過150 mg/kg，均不超過《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部[16]中二氧化硫殘留量規定的限量150 mg/kg。

單面針中的木蘭花堿具有明顯的抗炎、抗菌等藥理作用[19]，通過對不同產地單面針進行木蘭花堿含量測定，結果表明單面針木蘭花堿含量為0.05%～0.19%，說明不同產地的單面針樣品中木蘭花堿含量存在差異。

表5 30 批單面針重金屬及有害元素測定結果(mg/kg)

2.5 單面針藥材等級評價體系的初步研究

2.5.1 實驗材料 樣品信息見表2，批號為S1～S30，共計30 批。

2.5.2 等級劃分指標的確定 采用軟件SPSS 19.0對30 批單面針樣品外在特征和內在質量進行統計分析，見表7-9。

由表7 各指標的描述統計可知，單面針外觀特征指標雜質與直徑的變異系數分別為44.4%、22.2%。單面針內在指標成分木蘭花堿含量、總灰分、浸出物的變異系數分別為40.00%、17.9%、16.7%。 由表8各指標的相關性分析可知，直徑、木蘭花堿含量、浸出物、總灰分在0.01 水平上呈顯著的正相關。 由表9 對各指標的主成分分析可知， 主成分一的特征值為2.019，貢獻率為33.651%；主成分二的特征值為1.659，貢獻率為27.642%；主成分三的特征值為1.090，貢獻率為18.160%，累積貢獻率為79.453%，特征向量的大小代表各性狀指標對主成分貢獻的大小，綜合考慮特征值和貢獻率的大小，結合實際情況和可操作性，故選用直徑、浸出物、木蘭花堿含量作為藥材等級劃分指標。

表6 30 批單面針有機氯農藥殘留量、二氧化硫殘留量測定結果(mg/kg)

表7 單面針各測定指標的描述統計

表8 單面針各指標間相關性分析

表9 主成分分析

2.5.3 分級 將每批單面針樣品的直徑、浸出物、含量作為聚類指標，運用SPSS 19.0 統計分析軟件對30 批單面針樣品進行分析，結果見圖5。

由圖5 可以看出，將30 批單面針樣品分為3類：樣品S4 聚為一類，為一等品；樣品S11、S12、S13、S14、S15、S16、S20、S22、S23 聚為一類，為二等品；其他20 批樣品聚為一類，為統貨樣品，詳見表10。 初步建立了單面針藥材質量等級評價體系：1 批一等：醇溶性浸出物不少于6.8%，直徑不小于2.8 cm，木蘭花堿含量不少于0.19%；9 批二等：醇溶性浸出物5.8%～7.0%，直徑1.3～2.2 cm，木蘭花堿含量0.05%～0.17%；20 批三等：醇溶性浸出物3.9%～5.8%，直徑大小不等，木蘭花堿含量0.06%～0.16%。

表10 單面針藥材等級評價指標

圖5 30 批單面針樣品各指標聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 薄層色譜法

生物堿類化合物是單面針的主要活性成分之一，主要包含木蘭花堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿等，通常是評價該藥材質量的重要指標[20-21]。 以白屈菜紅堿[22]為對照進行薄層鑒別時，單面針特征斑點不明顯，而兩面針和偽品斑點特別明顯[9]，故未選擇白屈菜紅堿作為定性指標。 選擇了木蘭花堿和氯化兩面針堿為對照，進行了供試品溶液的制備方法、薄層色譜鑒別展開條件的考察及方法學驗證，薄層色譜鑒別可以很好分離和區分單面針、兩面針及偽品，提取方法簡單、快捷，斑點清晰，所用試劑易獲取，便于操作。

3.2 高效液相色譜法

單面針與兩面針均來源于蕓香科，化學成分比較相似，采用高效液相色譜法對不同產地單面針和兩面針進行對比分析，篩選出主要的差異成分為1 號峰，后續需對1 號峰進行提取分離、結構確證、藥理藥效研究，以確證1 號峰作為單面針特征性成分加以控制，以保障單面針基原準確，區分真偽品。

3.3 其他檢測項

按照《湖南省中藥材標準》（2009 年版）、《中華人民共和國藥典》（2020 年版）等方法對不同產地單面針藥材雜質、直徑、水分、總灰分、醇溶性浸出物、重金屬及有害元素、有機氯農藥殘留量、二氧化硫殘留量、木蘭花堿的含量等進行了全面的質量檢測，均符合現行質量標準及藥典要求，可為單面針質量標準完善提供數據支撐。

3.4 等級評價

通過對單面針藥材外觀特征和內在質量的全面分析，從描述性統計、相關性分析、主成分分析等確定了等級劃分指標。采用聚類分析對30 批單面針藥材建立了初步的三級等級評價體系，結果顯示，直徑越大，內在質量越優。一等品1 批，產地為湖南懷化；二等品共9 批，產地分別為湖南吉首5 批以及湖北、廣西、廣東、貴州各1 批；三等品共20 批，各個產地均有分布。 不同省份不同批樣品質量波動較大，同一省份不同批藥材也有一定的差異，但相對來講，湖南省樣品相對優質且批間穩定。由于收集到的30批單面針藥材生長年份不明確，故后續需對不同生長年份單面針質量進行更多的相關性和影響趨勢研究。

4 結論

本研究確證了薄層色譜法和高效液相色譜法能夠有效地鑒別和區分單面針藥材與兩面針藥材及常見混偽品，方法專屬性強、靈敏度高、簡便實用，薄層色譜法與高效液相色譜法能夠相互驗證、互為補充，提供了有效的質控手段，為規范中藥材市場奠定了基礎。 將傳統的外觀特征結合內在有效成分含量，初步建立了單面針3 個規格藥材的評價體系，實踐中容易掌握，為評價單面針藥材質量提供了數據支持，對藥材的采收與產地加工具有一定的指導和實踐意義，可以促進單面針商品藥材的市場價格秩序化、合理化，以滿足不同的臨床應用需求。