基于網絡藥理學分析燈盞乙素治療動脈粥樣硬化的分子機制和體內驗證

張 莉 ，王雨婷 ，石佳寧 ，余丹 ，楊仁華 ，沈志強 ，龍江 ，陳鵬

（1）昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500;2）昆明醫科大學第一附屬醫院神經外科，云南 昆明 650032）

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是世界范圍內人類死亡的主要原因之一，而動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是所有心血管疾病的病因和共同的病理生理基礎[1?3]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一組發展緩慢、復雜的炎癥性血管疾病，其特征是動脈壁增厚、硬化，失去彈性，管腔狹窄，血管內膜上積淀淡黃色動脈粥樣硬化斑塊，是臨床重多心血管系統疾病的關鍵的病理基礎。近年來研究表明，AS 發病呈現年輕化的趨勢[4?5]。因此，尋找AS 關鍵有效的預防靶點一直是心腦血管領域研究的熱點和重點。目前，他汀類藥物、抗血小板聚集藥物和一些中草藥復方制劑是臨床上常用一線的抗AS 藥物[6]。雖然這些藥物對AS 有一定的防治療效，但既往研究表明，長期使用他汀類藥物會導致肝腎損傷和橫紋肌溶解等不良反應[7]，甚至會出現橫紋肌溶解后急性腎衰竭而死亡等嚴重的后遺癥[8]。因此，關注AS 的發病機制對其防治AS 的病程進展具有非常重要的臨床價值。

燈盞花又名燈盞細辛，是云南特色藥用植物，其主要成分為燈盞乙素（Scutellarin），其結構式：4′，5，6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，見圖1。前人研究發現，燈盞乙素能改善高血糖引起的血管內皮細胞損傷[3]。與前人[9]的研究結果相似，筆者的研究表明燈盞乙素可以保護血管內皮細胞，并通過減少氧化作用發揮抗AS 的作用，而具體的分子機制并不清楚。結合上述研究結果，提示燈盞乙素具有潛在的抗AS 臨床價值，值得進一步深入研究。網絡藥理學是以系統生物學和多向藥理學為基礎，可以為研究者提供新的藥物研究策略，它可以通過構建“疾病-基因-靶點-藥物網絡，篩選出關鍵作用的靶點與生物學過程” 更直觀的向人們闡述藥物作用于疾病的生物學作用和潛在的分子機制[10]。因此，本課題結合網藥預測結果，同時復制APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，研究系列濃度的燈盞乙素對APOE-/-小鼠AS模型的胸主動脈斑塊組織中PI3K/AKT/mTOR 信號通路的調控作用及炎癥因子的影響，深入挖掘燈盞乙素抗 AS 的分子生物學作用機制，為AS 的預防和治療進一步提供全新的視角和實驗室數據支持。

圖1 燈盞乙素的化學結構式Fig.1 Chemical structure of Scutellarin

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 數據庫及軟件實驗中用到的數據庫和軟件如下：PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；PharmMapper 數據庫v2017（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；GeneCards 數據庫v5.6.0（https://www.genecards.org/）；DisGeNET Database v7.0（https://www.disgenet.org/）；Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org/）；Venny 2.1.0 軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；蛋白相互作用網絡平臺STRING v11.5（https://stringdb.org/）；DAVID v6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）；微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）；Cytoscape v3.9.0 軟件（https://cytoscape.org/），見表1。

表1 實驗涉及的部分數據庫Tab.1 Main databases involved in the experiment

1.1.2 藥物與試劑（1）云南省藥物研究所張人偉教授提供燈盞乙素，純度為98.8%。阿托伐他汀鈣由輝瑞公司提供。（2）燈盞乙素組每天以0.1 mL/10 g 體重進行灌胃。以28 mg/kg 的燈盞乙素組為例，將2800 mg 的燈盞乙素單體溶于100 mL 蒸餾的0.02 mmol/L NaOH 溶液中，調整pH 值至7.8。將上述28 mg/kg 劑量的溶液稀釋一半，以獲得燈盞乙素（14，7 mg/kg）溶液。（3）阿托伐他汀鈣（atorvastatin calcium，ATV）的配制，10 mg/kg 的阿托伐他汀鈣陽性對照組藥物，每天以0.1 mL/10 g 體重進行灌胃。

1.1.3 實驗動物70 只健康的ApoE-/-小鼠和20只健康的C57BL/6J 小鼠（雌雄各半），年齡8 周，體重（20±5）g，ApoE-/-小鼠由北京偉同利華實驗動物技術有限公司（北京，中國）購買。生產許可證號為SCXK（京）2012-0001。C57BL/6J 小鼠由昆明醫學院實驗動物系提供，生產許可證號為SCXK（滇）2015-0002。動物在潔凈的動物房中飼養，溫度18～25 ℃，濕度40%～70%。適應性飼養1 周后，開始實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 燈盞乙素（“Scutellarin”）的靶點篩選及網絡構建以“Scutellarin”為檢索詞，使用PubChem 數據庫下載燈盞乙素2D 結構式的SDF格式并復制燈盞乙素的Canonical SMILES 號。通過Swiss 數據庫預測藥物靶點時，提供PubChem數據庫下載的燈盞乙素的Canonical SMILES 號，即可得到該數據庫中燈盞乙素潛在的作用靶點；使用PharmMapper 數據庫查找燈盞乙素潛在作用靶點時，在PharmMapper 數據庫首頁點擊Submit job，將燈盞乙素結構式的SDF 格式導入，選擇Human Protein Targets Only，提交后可得到該數據庫中燈盞乙素的潛在作用靶點，由于在PharmMapper 數據庫下載的藥物靶點只有Uniplot格式，需要轉化為常見基因名，故使用Uniprot數據庫進行轉化，首先把PharmMapper 數據庫下載得到的靶點進行篩選，將Zscore 列設置為大于0.9，把篩選出的基因的Uniplot 列粘貼到Uniprot數據庫，選擇UniProtKB AC/ID to Gene name，提交后下載Target list。將2 個數據庫查的藥物靶點整合后，構建藥物-靶點網絡（Cytoscape 3.9.0）。

1.2.2 Atherosclerosis 靶點篩選輸入“Atherosclerosis”，通過DisGeNET Database v 7.0 和Gene Cards 數據庫檢索疾病靶點，按照篩選條件，將篩選結果整合后得到疾?。▌用}粥樣硬化）的潛在靶點。

1.2.3 Scutellarin 與 Atherosclerosis 的 Venny分析將燈盞乙素的作用靶點與動脈粥樣硬化的基因靶點進行Venny 分析，將共同靶點上傳Venny 2.1.0 數據庫構建韋恩分析圖，篩選得到共同作用靶點，即為燈盞乙素治療動脈粥樣硬化的作用靶點。

1.2.4 蛋白質相互作用關系網絡構建為了深入挖掘燈盞乙素潛在靶點與動脈粥樣硬化疾病靶點之間的潛在分子機制，現將篩選得到的共同作用靶點上傳STRING 數據庫，“Minimum required interaction score”設置為0.4（中等可信度），并隱藏不連接節點，其余數值均保持默認值，則蛋白質相互作用關系網絡圖繪制完成。

1.2.5 GO 富集分析為說明燈盞乙素的靶點在基因功能中的作用，將上述篩選出的燈盞乙素治療動脈粥樣硬化的作用靶點導入DAVID v6.8 數據庫中，按照FDR 值升序（FDR <0.05），篩選細胞組 成（cellular component，CC），生物學過程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）富集最顯著10 個GO 條目，利用微生信平臺繪制條形圖。

1.2.6 KEGG 通路富集分析KEGG 通路分析，按照FDR 值升序（FDR <0.05）篩選排名前20 的信號通路，計算通路富集倍數（Gene ratio），以P值作為參數，將數據導入微生信平臺進行數據可視化處理。

1.2.7 AS 模型的復制、給藥和血管取材適應性喂養7d 后，用西方高脂肪飲食（1%膽固醇、15%豬油、15%花生油、20%蛋黃粉、1%鹽和48%普通飲食）喂養ApoE-/-小鼠，用標準飲食喂養C57BL/6J 小鼠。12 周后，隨機犧牲6 只ApoE-/-小鼠和6 只C57BL/6J 小鼠，收集胸主動脈進行組織病理學評估，檢測動脈粥樣硬化的形成。確認模型構建成功后，將剩余的60 只動脈粥樣硬化模型小鼠隨機分為5 組（n=12）：動脈粥樣硬化模型組;7 mg/kg、14 mg/kg 和28 mg/kg 的燈盞乙素治療組；以及10 mg/kg 的阿托伐他汀鈣（atorvastatin calcium，ATV）作為陽性對照組；12只C57BL/6J 小鼠設為正常對照組。每周稱量調整劑量，治療組用不同劑量的燈盞乙素灌胃，每天1 次，每次0.1 mL/10 g，對照組和模型組用相同量的正常生理鹽水灌胃，持續12 周。取材前給予小鼠2%異氟烷吸入式麻醉。然后，分離每只小鼠的胸主動脈，最后小鼠吸入2%異氟烷過量致死。

1.2.8 HE 染色取各組小鼠總動脈一段固定后的主動脈，常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，以20 μm 厚度連續切片，每只動物從連續切片的第 5 張開始，每間隔 10 張選1 張，即第 5、15、25，共3 張切片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.9 ELISA 法檢測TNF-α 和IL-1β 的含量小鼠麻醉后，迅速眼球取血，離心，取上清，使用小鼠ELISA 的TNF-α 和IL-1β 試劑盒檢測各實驗組中小鼠分離提取血清實驗樣本TNF-α 和IL-1β 中含量。依據說明書依次加入試劑和樣品，用酶標儀在 450 nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素 1β（IL-1β）含量。

1.2.10 RT-PCR 確證差異基因為了研究燈盞乙素對AS 模型影響，進行RT-PCR 來檢測PI3K、AKT、mTOR、Bax、Bcl-2、Caspase-3 的mRNA水平。用TRIzol 試劑提取各組胸主動脈血管組織總RNA，并使用Quant Script RT 試劑盒進行逆轉錄。在ABI7900HT（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上進行PCR。2-ΔΔCT值用來表示PI3K、AKT、mTOR、Bax、Bcl-2、Caspase-3 RNA 的相對表達水平。隨機選擇并準備了7 條PCR 引物來分析頸總動脈的變化。PCR 條件如下：95 ℃熱變性40 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸45 s，共40 個循環。一式3 份的PCR，20 μL 的混合物含有4 μL 的5×FastPfu 緩沖液，2 μL 的dNTPs（2.5 mM），0.8 μL 的每個引物（5 μM），0.4 μL 的Fast Pfu 聚合酶，和10 ng 的模板DNA。則樣品中的相對mRNA 表達水平被確定為2-ΔΔCT。特定基因的引物序，見表2。

表2 引物序列Tab.2 The primer sequence

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 燈盞乙素（Scutellarin）靶點篩選

從PubChem 數據庫中得到燈盞乙素分子結構圖 的sdf 格式及Canonical SMILES 號，通過Pharm Mapper 數據庫、Swiss Target Prediction 數據庫尋找與燈盞乙素相關的潛在靶點，經篩選后共得到167 個靶點，主要有腫瘤壞死因子-a（TNFα）、NADPH 氧化酶4（NADPH oxidase 4）、MAP激酶p38α（MAP kinase p38 alpha）、P-糖蛋白1（Pglycoprotein 1）、淋巴細胞分化抗原 CD38（Lymphocyte differentiation antigen CD38）等。

2.2 成分-藥物靶點網絡構建

將“Scutellarin”與167 個潛在靶點經數據處理后上傳Cytoscape 3.9.0，即呈現燈盞乙素-靶點網絡圖，其中黃色代表燈盞乙素，灰色代表燈盞乙素作用的靶點，見圖2。

圖2 燈盞乙素-靶點網絡圖Fig.2 Scutellarin-target network

2.3 疾病靶點篩選

以“Scutellarin”為檢索詞，通過DisGeNET Database v7.0 數據庫和Gene Cards 數據庫分別進行檢索，共得到5197 個與AS 的相關靶點，包括低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素6（interleukin 6，IL-6）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1）等。

2.4 PPI 網絡構建

將藥物和疾病靶點依次上傳至Uniprot 數據庫進行靶點基因標準化，再通過 Venny 2.1 軟件繪制韋恩圖及藥物-疾病-靶點網絡圖，其中AS 靶點用黃色表示，燈盞乙素靶點用藍色表示，2 部分交集得到106 個共同靶點，見圖3；將共同靶點上傳STRING 繪制PPI 網絡，見圖4。

圖3 燈盞乙素-動脈粥樣硬化-靶點網絡Fig.3 Intersection of Scutellarin predicted targets and atherosclerotic targets

圖4 燈盞乙素治療動脈粥樣硬化潛在靶點的PPI 網絡Fig.4 PPI network of potential targets of Scutellarinl on anti-AS

2.5 核心靶點篩選

將PPI 圖的tsv 格式導入Cytoscape v3.9.0 軟件，在Cytohubba 中提交，選擇排名前20 的靶點制作核心靶點圖，見圖5。

圖5 核心靶點篩選Fig.5 Core target screening

2.6 GO 功能富集分析

將上述共同靶點上傳至DAVID v6.8 數據庫，通過DAVID 數據庫對106 個差異基因進行GO 功能富集分析，其中共得到239 個生物學過程（biological process，BP），主要包括MAP 激酶活性的正調控（Positive regulation of MAP kinase activity）、平滑肌細胞增殖的正調控（Positive regulation of smooth muscle cell proliferation）、Ras 蛋白信號轉導（Ras protein signal transduction）等；41 個細胞組成（cellular component，CC），主要涉及細胞外空間（Extracellular space）、細胞溶質（Cytosol）、薄膜（Membrane）；68 個分子功能（molecular function，MF），主要包括蛋白酶結合（Protease binding）、酶結合（Enzyme binding）等，見圖6。

圖6 燈盞乙素治療動脈粥樣硬化潛在靶點的GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of potential targets of Scutellarin for anti-atherosclerosis

2.7 KEGG 通路富集分析

同樣，筆者得到20 條與AS 相關的KEGG 信號通路，依據是按照P值升序排列，主要包括PI3K/AKT 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等，筆者用“微生信”平臺處理上述信號通路，其中與AS 相關且涉及該通路的基因數用氣泡大小代表示，顏色深淺代表富集顯著性，見圖7。

圖7 燈盞乙素治療AS 潛在靶點的KEGG 通路分析Fig.7 KEGG pathway analysis of potential targets of Scutellarin on anti-atherosclerosis

2.8 HE 染色結果

HE 染色顯示，正常組小鼠主動脈內膜完整，排列緊密，中膜平滑肌細胞排列整齊，未見明顯增厚的現象，無脂質沉積，無炎性細胞的浸潤。與正常組相比，AS 模型組則表現出內皮細胞損傷嚴重，部分內膜脫落，內膜上可見大小不等的斑塊，見黑色箭頭。經過陽性藥物阿伐他汀鈣（atorvastatin calcium，ATV）治療后，病理改變明顯減少，內膜基本完整，增厚不明顯，中膜平滑肌細胞增生明顯減少。與AS 模型組相比，7 mg/kg Scutellarin 治療組內膜上可見大小不等的斑塊，并伴有大量的炎癥細胞的浸潤，平滑肌細胞排列也比較紊亂；14 mg/kg Scutellarin 治療組內膜增厚情況減輕，泡沫細胞數量減少明顯，平滑肌細胞排列整齊程度有所改善，且脂質沉積情況有所改善；28 mg/kg Scutellarin 治療組內膜增厚程度明顯減輕，泡沫細胞數量減少，中膜平滑肌細胞排列變得較為整齊，脂質沉積幾乎沒有出現，細胞間隙減小，見圖8。

圖8 HE 染色結果（200×）Fig.8 HE staining results（200×）

2.9 RT-PCR 確證差異基因的結果

RT-qPCR 結果提示，和正常組相比，模型組PI3K、AKT、mTOR 和Bcl-2 的mRNA 表達量明顯升高（P<0.01）；Bax 和Caspase-3 的mRNA表達量明顯降低（P<0.01）；和模型組相比，燈盞乙素組則呈濃度依耐性地下調PI3K、AKT、mTOR 和Bcl-2 的mRNA表達，上調Bax 和Caspase-3 的mRNA表達（P<0.05），見圖9A，圖9B。

2.10 ELISA 結果

和正常組相比，模型組血清TNF-α 和IL-1β 的含量明顯升高，（P<0.01）。和模型組相比，燈盞乙素則呈濃度依耐性地下調小鼠血清TNFα 和IL-1β 的含量（P<0.05），見圖9C，圖9 D。

圖9 燈盞乙素對PI3K/AKT/mTOR 信號通路及炎癥因子的影響[（ ），n=6）]Fig.9 Effects of Scutellarin on PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related genes and inflammatory factors[（ ），n=6）]

3 討論

動脈粥樣硬化的病程進展與慢性炎癥反應、氧化應激等病理過程密切相關，尋找有效的防治AS 的靶點有重要的臨床意義。燈盞花在傳統的中醫中藥有著悠久的民族藥理歷史，燈盞乙素作為一種燈盞花的主要活性成份，目前學者們正在研究其對各種組織損傷的保護作用。課題組前期研究發現燈盞乙素可通過降低胞內Ca2+濃度、促NO、釋放抗脂質過氧化及調控抗氧化酶與氧化酶活性等，降低氧化應激作用保護血管內皮細胞，發揮抗動脈粥樣的作用[9]，然而其作用機制并不明確，同時缺乏分子水平的驗證研究。因此，深入研究分析燈盞乙素抗動脈粥樣硬化的作用機制，探索其潛在作用靶點，對臨床應用提供重要的參考價值。

本研究采用網絡藥理學方法構建基于Scutellarin 的“藥物-作用靶點-疾病”網絡[10]。筆者的PPI 交互用網絡研究結果提示，燈盞乙素與AS 的交集靶點包括LDL-R，TNF-α，AKT1等，參與機體的各種炎癥和氧化應激反應過程，以上結果表明Scutellarin 可能是通過這些靶點來干預動脈粥樣硬化的病程進展的。GO 功能富集分析顯示BP 主要包括MAP 激酶活性的正調控、平滑肌細胞增殖的正調控、Ras 蛋白信號轉導等多數與平滑肌細胞增殖，氧化應激反應等相關，推測燈盞乙素干預 AS 的病程進展與平滑肌細胞增殖等相關的生物過程密切相關。另外，KEGG結果表明，燈盞乙素可同時作用于多種與AS 疾病相關的信號通路，包括PI3K/AKT 信號通路（hsa04151）、Ras 信號通路（hsa04014）、MAPK 信號通路（hsa04010）等，其中PI3K/AKT 信號通路顯著富集。大量研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信號通路與血管平滑肌細胞的增殖和遷移密切相關[11]。白藜蘆醇可通過調控PI3K/AKT 信號通路抑制此效應發生，發揮抗肺動脈高壓治療作用[12]。另有研究證實[13]，磷酸化蛋白分子p-AKT、p-mTOR的過度表達可引起肺動脈平滑肌細胞的增殖。綜上，燈盞乙素治療AS 是通過多成份，多靶點，多途徑發揮協同作用的，筆者發現 PI3K/AKT 信號通路參與增殖、分化、凋亡等多細胞多因子的調節功能，在細胞代謝、細胞周期調控及細胞增殖凋亡等諸多生物學過程中發揮著關鍵作用，因此筆者選擇PI3K/AKT 信號通路作為筆者研究的靶標。

因此，結合網絡藥理學預測結果，筆者在APOE-/-小鼠AS 動物模型上進行RT-PCR 的驗證。因為AS 動物模型是研究動脈粥樣硬化病理生理機制、尋找有效藥物的重要前提，選擇和復制合適的動物模型是評價抗 AS 作用必不可少的研究工具[14]。筆者選擇高脂飲食喂養的APOE-/-小鼠復制AS 動物模型，該模型顯示了頭干動脈粥樣硬化伴不穩定AS 斑塊的特征，被認為是研究動脈粥樣硬化的理想模型[15]。在AS 整體動物模型上，RT-qPCR 的驗證結果提示，Scutellarin 通過調控PI3K/AKT/mTOR 信號通路，抑制炎癥反應，促進細胞凋亡。筆者的實驗數據進一步確認了燈盞乙素治療AS 的可靠性，為其進一步進入臨床應用提供數據支持。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學的分析方法，結合有效成分、靶點預測、GO 富集分析、KEGG 分析等，從系統的角度預測了燈盞乙素治療動脈粥樣硬化的分子機制。另外，通過APOE-/-小鼠AS 模型對篩選出的靶點進行驗證，確認燈盞乙素調控PI3K/AKT/mTOR 信號通路，抑制小鼠AS 模型炎癥反應的過程，促進細胞凋亡，從而達到治療AS 的目的。本研究可為將燈盞乙素研究成為自主創新和云南特色植物來源的防治AS 的藥物提供理論和實驗依據。