抗菌肽LL-37 對尿路上皮細胞跨膜屏障功能破壞的作用

楊童欣，王光，徐蕊，蘇思維，方克偉，劉建和，李炯明

（昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，云南 昆明 650101）

間質性膀胱炎（interstitial cystitis，IC）是一種病因不明的慢性疾病，又稱膀胱疼痛綜合征，以儲尿期的膀胱疼痛和尿頻、尿急等非特異性癥狀為特征[1]。流行病學研究表明，IC 的發病率大約為0.1%；近來，IC 在女性群體中的發病率上升至2%左右，其危險因素包括女性激素使用、妊娠終止、妊娠相關（膀胱壓迫、尿路感染）和精神類疾病，尤其是抑郁癥和恐慌癥[2]。

膀胱壁尿路上皮的尿液屏障功能主要由位于膀胱粘膜層的尿路上皮細胞及存在于其細胞間隙的葡萄糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）構成，是阻礙尿液成分向尿路上皮下滲透的關鍵結構[3]。尿路上皮對尿液的屏障缺陷使尿液中的高滲透性物質侵入到膀胱黏膜下層次，誘發尿路上皮及其固有層炎癥水腫反應[4]，可能是引起IC 的主要原因。因此，研究尿路上皮尿液屏障異常的機制對IC 的臨床診斷和治療十分重要。

IC 患者膀胱壁的病理檢測多表現為炎癥反應和實質纖維化[5]。LL-37 是目前已知一類可由人體自身細胞合成的抗菌肽，是泌尿系統感染過程中天然的抗生素和免疫調節劑[6]。然而，已有研究證實，一定劑量的LL-37 對真核細胞具有細胞毒性[7]。尿液中如果持續存在過高濃度的LL-37，則有可能誘發炎癥反應，逐步破壞尿路上皮細胞的跨膜屏障功能，導致IC/BPS 相關臨床癥狀和病理改變出現。Martin 等[8]報道，LL-37 膀胱灌注可誘導IC 小鼠模型。

本研究團隊在前期研究中已成功構建抗菌肽LL-37 誘導大鼠膀胱炎癥反應模型，并證實在該模型中大鼠膀胱壁肥大細胞脫顆?，F象顯著，相關炎癥因子表達明顯上調，說明大鼠LL-37 膀胱灌注是有效的BPS/IC 動物實驗模型[9]。在本研究中，筆者進一步通過LL-37 在體外實驗條件下誘導尿路上皮細胞，探討LL-37 對尿路上皮細胞屏障功能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞人尿路上皮永生化細胞SVHUC-1（貨號：HT-X1556）購自深圳豪地華拓生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑F12K 培養基（貨號：21127030）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Thermo Fisher；1%雙抗購自武漢普諾賽生命科技有限公司；TRIzol 試劑購自美國Life Technologies；逆轉錄試劑盒（TIANSeq M-MLV 逆轉錄酶）、SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒（SuperReal PreMix Plus）購自北京天根生化科技有限公司；熒光定量PCR 引物自上海生工生物工程股份有限公司訂制；RIPA 裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 試劑盒、PVDF 膜、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；HS3ST2、β-actin 抗體英國Abcam；抗菌肽LL-37 購自美國MCE。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養將SV-HUC-1 細胞培養在含10% FBS 和1%雙抗的F12K 培養基中，置于5%CO2的37 ℃細胞培養箱中常規培養24 h。

1.2.2 細胞處理及分組將SV-HUC-1 細胞分別暴露于0（對照組）、0.1、1、10、20、100、200 μg/mL LL-37 的環境中24 h，隨后分別用上皮細胞跨膜電阻儀、CCK-8 和流式細胞儀檢測細胞的跨膜電阻、細胞增殖活力、細胞周期和鈣離子濃度。再將上述分組處理的細胞收獲后，采用RTqPCR 和Western blot 檢測GAGs 關鍵成分硫酸乙酰肝素的表達水平。

1.2.3 RT-qPCR 檢測mRNA 的表達收集各組SV-HUC-1 細胞，采用TRIzol 試劑法提取各組細胞中的總RNA，再采用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，最后采用SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒配置RT-qPCR 反應96 孔板，在Applied Biosystems 7500 型定量PCR 儀上進行反應。反應條件為：94 ℃ 15 min，隨后95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃32 s 循環40 次。mRNA 相對表達水平采用2-ΔΔCT法計算。以GAPDH 為內參，進行歸一化處理。引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 Western blot 檢測通路蛋白表達用蛋白抑制劑修飾的RIPA 裂解液裂解SV-HUC-1 細胞，獲得細胞中的總蛋白，用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質的濃度和純度。每通道加入50 μg 蛋白質在10% SDS-PAGE 凝膠上進行電泳分離，隨后轉移至PVDF 膜上。室溫下用含5%脫脂牛奶的TBS 溶液封閉PVDF 膜2 h，再與一抗4 ℃條件下孵育過夜。次日用TBST 緩沖液洗滌PVDF 膜3 次，隨后用與辣根過氧化物酶結合的二抗在室溫下孵育30 min。TBST 緩沖液再次清洗膜并用ECL 化學發光試劑處理1 min。最后使用熒光成像系統成像，利用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值并記錄實驗數據。

1.2.5 CCK-8 檢測細胞增殖活力收集細胞，調整細胞密度為2×104個/mL 的單細胞懸液，向96 孔板中接種細胞，每孔100 μL，培養板置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。分別在培養后的第6、12、24、36、48 h 時向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液。繼續培養2 h，通過酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值，記錄實驗數據。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞周期和鈣離子細胞周期檢測：調整細胞，在每個培養皿中加入1×105個細胞，細胞培養箱中過夜培養。PBS 清洗細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞于離心管中，11000 r/min 離心6 min，棄上清。將預冷的PBS 溶液加至離心管，反復輕輕吹打細胞，清洗2 次后，將細胞收集至EP 管，同時向EP 管中加入500 μL 預冷的乙醇，混勻，4 ℃過夜孵育。取出細胞，1100 r/min 離心6min，加入預冷的PBS 洗滌，再次離心，棄上清。加入500 μLPBS重懸細胞，同時加入10 μL RNase A 溶液37 ℃孵育。30 min 后，加入5 μL PI 染液混勻，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

鈣離子檢測：Fluo-3 AM 用無水DMSO 溶解，向儲存液中加入等20%體積的Pluronic 溶液，制得2～5 mM 的儲存液。將Fluo-3 AM 溶液用HBSS 稀釋制得4μM 的Fluo-3 AM 工作液。向細胞中加入Fluo-3 AM 工作液，細胞培養箱中繼續培養。20 min 后向細胞中加入5 倍體積的含1%FBS 的HBSS，繼續培養40 min。用HEPES 生理鹽水緩沖液洗滌細胞3 次，再用HEPES 生理鹽水緩沖液重懸細胞，制得1×105個/mL 的細胞懸液。置于細胞培養箱中培養10 min，流式細胞儀檢測鈣離子水平。激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。

1.2.7 上皮細胞跨膜電阻測量儀檢測跨上皮細胞電阻將各組細胞接種至Transwell 嵌套的6 孔培養板，電阻測量儀的電極分別插入上部空間和下部空間。將細胞培養液和空白電阻嵌套培養板電阻的和設為空白值，每隔12 h 測定跨上皮細胞電阻，當跨上皮細胞電阻值達30 Ohm cm2（Ωcm2）時開始正式測量。小心移除培養板上的液體，細胞用37 ℃預熱的HBSS Hanks 洗滌3 次，向每孔中加入細胞培養液，檢測各組細胞的跨上皮細胞電阻值。

1.3 統計學處理

所有實驗數據采用GraphPad Prism 9.0 進行數據分析并作圖。其中，2 組間比較采用Student’ st檢驗，多組間比較采用one-way ANOVA 檢驗，若ANOVA 檢驗差異有統計學意義則進一步采用Dunnett-t 檢驗進行兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LL-37 可促進尿路上皮細胞小分子溶質屏障功能受損并抑制細胞增殖

采用不同濃度的LL-37 處理尿路上皮永生化細胞SV-HUC-1，通過上皮細胞跨膜電阻測量儀檢測各組細胞的跨膜電阻，結果表明，0.1、1、10、20 μg/mL LL-37 處理對SV-HUC-1 細胞的跨膜電阻沒有顯著影響（對照組至20 μg/mL LL-37組TEER 值分別為 [（67.36±4.95）、（65.45±6.71）、（71.01±2.83）、（69.60±2.47）、（67.28±4.60 ）] Ωcm2，100 和200 μg/mL LL-37 可顯著抑制細胞的跨上皮電阻（100 μg/mL 和200 μg/mL LL-37 組TEER 值分別為[（54.42±5.66）、（41.89±3.89 ）] Ωcm2，且差異有統計學意義（P<0.05），見圖1A。CCK-8 檢測顯示，與對照組相比，SV-HUC-1 細胞的增殖活力可被100 μg/mL LL-37 顯著降低（P<0.05），見圖1B，在1 和10μg/mL LL-37 組中當培養至48 h 時也可見細胞的增值活力顯著低于對照組。通過流式細胞術檢測細胞周期，結果表明，與對照組相比[G0/G1：（31.83±1.89）%]，100 和200 μg/mL LL-37 同樣可顯著提高SV-HUC-1 細胞處于G0/G1 期的比例 [100 μg/mL LL-37 組G0/G1：（36.62±1.63）%；200 μg/mL LL-37 組G0/G1：（36.25±2.06）%；與對照組相比（P<0.05）]，見圖1C、圖1D。說明細胞增值受到顯著抑制。

圖1 LL-37 顯著降低SV-HUC-1 細胞的增殖活力和跨膜電阻Fig.1 LL-37 significantly reduced the proliferative activity and transmembrane resistance of SV-HUC-1 cells

2.2 LL-37 調控膀胱尿路上皮細胞中鈣離子濃度和GAGs 的產生

通過流式細胞術檢測SV-HUC-1 細胞中的鈣離子濃度，結果表明，LL-37 處理后的尿路上皮細胞內鈣離子濃度顯著升高，其中，1 μg/mL LL-37 既可使細胞內鈣離子濃度升高，（104.11±55.67）vs（273.92±73.64），差異有統計學意義（P<0.05），見圖2A、圖2B。10 和100 μg/mL LL-37 則進一步顯著提高細胞內鈣離子濃度[（104.11±55.67）vs（345.45±16.95），（104.11±55.67）vs（349.73±36.92），（P<0.01）]見圖2A、圖2B。經RT-qPCR 檢測各組細胞中GAGs 關鍵成分硫酸乙酰肝素的表達水平，結果顯示，10 μg/mL 和100 μg/mL LL-37 組SV-HUC-1 細胞中HS3ST2 的表達顯著高于對照組，其中10 μg/mL組HS3ST2 表達平均上調1.88 倍（P<0.05），見圖2C，100 μg/mL 組HS3ST2 表達平均上調7.61倍（P<0.01），見圖2C。再采用WB 驗證HS3ST2在蛋白表達水平的差異，結果顯示，與對照組相比1μg/mL 組HS3ST2 蛋白表達平均上調2.41 倍（P<0.05），見圖2D。10 μg/mL 組和100 μg/mL 組蛋白表達分別平均上調3.23 倍和3.41 倍（P<0.01），圖2D。

圖2 LL-37 調控SV-HUC-1 細胞內鈣離子濃度和GAGs 關鍵成分硫酸乙酰肝素的表達Fig.2 LL-37 Regulating the Intracellular Calcium Ion Concentration of SV-HUC-1 and the Expression of heparan sulfate，a key component of GAGs

3 討論

IC 是一種以“儲尿期下腹部、會陰部慢性疼痛，迫使患者反復排尿”為表現的疾病，嚴重時可影響患者的身心健康，降低患者的家庭和社會活動能力。由于對該疾患的發生和發展尚無清晰認識，臨床工作中只能以患者的主觀癥狀和排除其他可能疾病作為診斷依據，并給予經驗性的治療，許多患者與膀胱疼痛癥狀終生相伴。因此，探索和解釋 IC 的病因和發病機制，從中尋找有效的治療方法，是目前泌尿尿控亞?？瓢l展亟待攻克的難題。

LL-37 是一種人類抗微生物肽，可由多種類型的細胞合成，包括上皮細胞和循環中性粒細胞[10]，在感染相關的或感染無關的IC 患者尿液中水平升高[11?12]。LL-37 是一種高效的炎性氨基酸序列，可在尿路上皮引起細胞凋亡，誘導白細胞趨化，刺激肥大細胞脫顆粒，增強中性粒細胞功能，誘導炎性趨化因子，增加組織中的血管形成，增加細胞外基質沉積使膀胱壁纖維化[10，13]。Oottamasathien 等[12]報道，LL-37 在IC 患者中表達升高，在小鼠LL-37 劑量遞增小鼠實驗中，較高濃度的LL-37 會增加小鼠的IC 炎癥反應，同時肥大細胞浸潤明顯增加。Lee 等[14]研究發現，LL-37 可迅速誘導尿路上皮細胞中ATP 的釋放和細胞凋亡，GAG 類似物GM-0111 可通過阻斷細胞凋亡和尿路上皮細胞釋放ATP 抑制IC 的發展。

本項研究在既往動物實驗的基礎上[9]，首次在體外實驗條件下使用抗菌肽LL-37 刺激尿路上皮細胞。通過上皮細胞跨膜電阻測量和細胞內鈣離子濃度測定證實了LL-37 可在體外實驗條件下破壞尿路上皮細胞的跨膜屏障功能，通過CCK8試劑盒和流式細胞術細胞周期檢測證實了LL-37可在體外實驗條件下抑制尿路上皮細胞的增殖活性，并通過RT-qPCR 和WB 檢測證實了LL-37可在體外實驗條件中下調尿路上皮細胞GAGs 關鍵成分硫酸乙酰肝素的表達，上述特征符合IC 的臨床表現。此外，通過對LL-37 不同濃度梯度條件下尿路上皮細胞GAGs 表達差異和跨膜屏障破壞程度的檢測，筆者探明了適于體外研究尿路上皮跨膜屏障損傷機制的實驗方案，有助于系列課題的進一步開展和對IC 病理機制的深入研究。

目前，已有報道JAK/STAT[15]、AKT/mTOR[16]、NF-κB[17]等信號通路參與調控IC 發生與發展。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是真核生物特有的進化保守信號轉導酶，C-JUN N 端激酶（JNK）是MAPK 超家族成員，是參與炎癥發生的重要信號通路。JNK 可在包括氧化應激和細胞因子等刺激下被激活和磷酸化，激活的JNK 磷酸化C-JUN，促進激活蛋白AP-1 轉錄因子復合物的形成，這些復合物參與了多種炎癥基因的形成[18?19]。Zhao 等[20]研究發現，JNK 信號通路在IC 患者中被激活，JNK、C-JUN、p-JNK、p-CJUN、IL-6 和TNF-α 表達顯著增加，導致IC 中的炎癥，JNK 抑制劑可有效抑制p-JNK、p-CJUN、IL-6 和TNF-α 表達，抑制IC 模型大鼠的膀胱炎，改善膀胱排尿功能。Song 等[15]研究發現，miR-132 在IC 模型大鼠膀胱組織中表達升高，抑制miR-132 可阻斷制JAK/STAT 信號通路的激活，從而減少IC 大鼠膠原纖維、炎性細胞浸潤和肥大細胞減少，抑制IL-6、IL-10、IFN-γ、TNFα、ICAM 1、Collagen I/III 型膠原表達，減輕IC炎性反應和膀胱逼尿肌纖維化。本課題組將利用已掌握的抗菌肽LL-37 大鼠IC 動物模型和本文中展示的體外抗菌肽LL-37 尿路上皮跨膜屏障損傷模型進一步IC 疾病的發生和發展過程進行深入研究，以期揭示IC 疾病的病理過程和轉化有針對性的臨床診療方案。

綜上所述，抗菌肽LL-37 可抑制SV-HUC-1細胞內GAGs 關鍵成分硫酸乙酰肝素的表達，并破壞SV-HUC-1 的細胞增殖和跨膜屏障功能。對該體外細胞實驗模型的進一步研究將有助于揭示IC 疾病發生過程。