白細胞介素-4 在脂多糖誘導急性肺損傷模型中的保護作用

趙 琨 ，肖云 ，楊純 ，嚴志凌 ，董敏娜 ，向柄全 ，肖茗耀

（1）昆明醫科大學第三附屬醫院重癥醫學科;2）婦瘤科，云南 昆明 650118;3）昆明醫科大學第一附屬醫院急診醫學部，云南 昆明 650032）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺內外的各種病因導致的急性低氧性呼吸功能不全綜合癥，其嚴重時可發展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），大量炎癥因子的激活是ALI 發展為ARDS 的主要機制，因此，調節炎癥和凋亡可能是治療ALI 的新方案[1]。有研究[2]認為，模式識別受體可以啟動炎癥信號級聯反應和促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和 IL-6 的釋放；刺激自噬或細胞凋亡，進而導致ALI 向 ARDS 進展。

調節性T 細胞（regulatory T cells，Treg）是一類控制體內自身免疫反應性的T 細胞亞群，它的抑制功能對于控制自身免疫、過敏和炎癥反應及至關重要，在ALI 的發展過程中起到保護性作用[3?4]。IL-4 是Th2 細胞分泌的細胞因子，其對于Treg 介導的免疫抑制可能具有多種正向調節作用[5]。但對于在ALI 中IL-4 是否能夠改善患者預后，目前鮮有報道。本研究將從體外細胞水平研究在ALI 中IL-4 對細胞凋亡及細胞因子分泌的作用，為臨床ALI 診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人肺上皮細胞A549 細胞購自美國ATCC 細胞庫，SYBR Green qPCR Mix 2.0 試劑盒購自廣州Genecopoeia 公司，Caspase-3 抗體購自Abcam，Bcl-2 抗體購自GeneTex，IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-γ 的 ELISA 試劑盒均購自NeoBioscience，IL-4 細胞因子購自PeproTech。

1.2 研究方法

1.2.1 LPS 最佳干預條件測定使用含10%胎牛血清的DMEM 培養液培養A549 細胞72 h 后，將A549 細胞分為13 組，向培養基中加入LPS，使得培養基中LPS 濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL，每個濃度對應3 組A549 細胞，將上述各濃度中的3 組細胞分別在含LPS 的培養基中培養12 h、24 h、48 h，以未加入LPS的A549 細胞培養48 h 為空白對照。培養結束后，使用流式細胞術檢測細胞凋亡率，確定LPS 的最佳干預濃度及時間。

1.2.2 IL-4 對ALI 細胞凋亡的影響選用上述最佳LPS 干預濃度及時間誘導A549 細胞凋亡，并將A549 細胞分為濃度控制組及時間控制組，每組各3 個亞組：濃度控制組的3 個亞組在加入LPS 的同時，分別加入0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL 的IL-4，與同時LPS 同時干預12 h；時間控制組的3 個亞組分別在加入LPS 前12 h、加入LPS 后6 h、加入LPS 后9 h 加入1 μg/mL 的IL-4，即IL-4 分別干預24 h、6 h、3 h；以只使用LPS 干預的A549 為對照組，不使用LPS 及IL-4干預的A549 為空白組。干預完成后，流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，實時熒光定量PCR（qPCR）檢測Caspase3、Bcl-2 的mRNA 的表達，蛋白質印跡法（Western blotting）檢測Caspase3、Bcl-2 的蛋白表達情況。

1.2.3 IL-4 對ALI 中各細胞因子的影響使用上一部分確定的最佳IL-4 干預濃度及時間，使用LPS 及IL-4 同時干預實驗組A549 細胞，對照組A549 細胞僅使用LPS 干預，空白組A549 細胞則不進行干預。干預結束后，離心取細胞培養上清液，酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）法測定各組細胞上清液中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、TNFγ 分泌情況。

1.3 統計學處理

使用SPSS 21.0 對數據進行分析，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析后使用Sidak 法進行多重比較，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS 最佳干預條件

通過不同濃度LPS 對A549 細胞培養進行不同時長的干預，根據A549 細胞凋亡情況，LPS濃度10 μg/mL 干預時間12 h 時，A549 細胞凋亡率最高，見圖1。認為此條件為LPS 誘導A549 細胞體外ALI 的最佳干預條件。

圖1 LPS 最佳干預條件Fig.1 Optimal LPS intervention concentration

2.2 IL-4 對ALI 細胞凋亡影響的結果

使用上述LPS 濃度誘導A549 細胞形成ALI，作為對照組。與空白組（正常A549 細胞）相比，對照組的細胞凋亡率顯著升高（1.86% vs 10.37%），差異有統計學意義（P<0.05）。IL-4 干預組細胞凋亡率顯著低于對照組（P<0.001）。當干預時間相同，均為12 h 時，細胞凋亡率隨IL-4 干預濃度的增加而降低（6.82% vs 3.38% vs 0.60%），差異有統計學意義（P<0.05）；當IL-4 濃度均為1 μg/mL 時，干預3 h 及6 h 細胞凋亡率無明顯變化（5.01% vs 4.95%），差異無統計學意義（P>0.05）；而干預12 h 及24 h 以后，細胞凋亡率逐漸降低（3.38%，P=0.001；2.07%，P<0.001），差異有統計學意義（P<0.05），見圖2、圖3。

圖2 各組細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis in each group

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡結果Fig.3 The results of apoptosis detected by flow cytometry

以β-actin 為內參，各組Caspase-3 與Bcl-2 蛋白表達水平，見圖4。與空白組相比，對照組中Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高（1.75 vs 2.00，P=0.017），Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（1.27 vs 0.31，P<0.001）。與對照組相比，IL-4 干預的各實驗組Caspase-3 蛋白表達水平均下降（P=0.0122），干預時間均為12 h 時，Caspase-3 蛋白表達水平隨IL-4 濃度增加而下降（1.56 vs 0.87 vs 0.31）；當IL-4 濃度均為1 μg/mL 時，干預6 h 及12 h 時Caspase-3 蛋白表達水平降至最低（0.86 vs 0.87，P>0.05），干預24 h 后表達水平回升（0.87 vs 1.17，P>0.05）。IL-4 干預各組的Bcl-2蛋白表達水平均高于對照組（P<0.001），干預時間均為12 h 時，IL-4 濃度為1 μg/mL 時，Bcl-2蛋白表達水平顯著高于0.1 μg/mL（0.51 vs 1.36，P<0.001），但IL-4 濃度升高到10 μg/mL 以后，Bcl-2 蛋白表達也未明顯升高（1.36 vs 1.41，P>0.05）；干預濃度均為1 μg/mL 時，IL-4 干預12 h后的Bcl-2 蛋白表達水平明顯上升（0.54 vs 1.36，P<0.001），但繼續干預至24 h 后，Bcl-2 蛋白表達水平也未繼續升高（1.36 vs 1.27，P>0.05）。qPCR 驗證Caspase3、Bcl-2 mRNA 表達情況的結果與其蛋白表達結果一致，以GAPDH 為內參，各組Caspase-3 與Bcl-2 mRNA 表達水平，見圖5。

圖4 各組Caspase3、Bcl-2 蛋白表達情況Fig.4 Expression of Caspase3 and Bcl-2 proteins in each group

圖5 各組Caspase3、Bcl-2 mRNA 表達情況Fig.5 mRNA expression of Caspase3 and Bcl-2 in each group

2.3 IL-4 對ALI 中各細胞因子影響的結果

雖然IL-4 降低ALI 細胞細胞凋亡、抑制Caspase3 表達的效果隨濃度和作用時間逐漸加強，但其促進Bcl-2 表達的效果在IL-4 濃度為1 μg/mL，作用12 h 時達到高點，因此后續研究均在此條件下進行。與空白組（正常A549 細胞）相比，對照組（ALI）IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ分泌顯著增多，IL-10 分泌降低（P<0.05）；經1 μg/mL。的IL-4 干預12 h 后，實驗組IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌顯著降低，低于對照組（P<0.05）；而實驗組IL-10 分泌增加，高于對照組（P<0.05）。各組細胞因子分泌濃度見表1、圖6。

圖6 各組細胞因子分泌情況Fig.6 Secretion of cytokines in each group

表1 各組細胞因子分泌情況（pg/mL）Tab.1 Secretion of cytokines in each group（pg/mL）

3 討論

ALI 是肺內外的各種病因導致的急性低氧性呼吸功能不全綜合癥，其發病機制復雜，治療效果不佳，平均病死率高達50%以上[6]，研究認為炎癥與抗炎反應的平衡被打破是導致肺部炎性損傷的主要原因之一[1]。當肺部受到肺內外的各種病因因素影響時，中性粒細胞通過肺泡巨噬細胞和其他肺細胞類型產生的趨化信號募集到肺泡腔內部，釋放蛋白酶、氧自由基、花生四烯酸代謝產物等損傷肺泡毛細血管內膜[7?8]。急性肺損傷的進展過程中炎癥和抗炎反應持續發生，促炎癥細胞因子，例如 IL-1、IL -6、TNF-α、TNF-γ等是引發肺部炎癥反應的主要介質。其他炎癥分子如趨化因子，巨噬細胞和中性粒細胞等則促進肺部炎癥的進展[9]。

Tregs 是存在于正常人體內的一種具有負向調節免疫功能特征T 細胞亞群，其在維持免疫穩態中具有重要意義[10]。當Treg 細胞受到抗原特異性刺激活化時，能夠通過分泌抑制性細胞因子IL-10，轉化生長因子β1（TGF-β1）等細胞因子介導免疫抑制，防止機體發生過度的免疫反應[11]。Garibaldi[3]等的研究證實，Treg 能夠通過抑制LPS 損傷后肺纖維細胞募集，從而減輕急性肺損傷過程中的肺纖維化。而在ALI 炎癥修復期，肺泡內 Treg 細胞數量明顯增多。臨床觀察也證實了肺泡 Treg 細胞較多的ALI 患者死亡率降低[4]。因此，Treg 可能能夠減輕ALI 患者的炎癥反應，加強 ALI 修復期的修復作用。

抗炎細胞因子IL-4 主要由CD4+T 細胞產生的，具有多種生物學活性，對B 細胞、T 細胞、肥大細胞和單核巨噬細胞都具有免疫調節作用[12]。研究表明，在IL-4 敲除的小鼠 ALI 模型中，其發病進展及炎癥反應遠高于ALI 正常小鼠模型，這表明IL-4 在ALI 過程中扮演重要角色[13?14]。Wehrmann F[15]等研究發現，γδ T 細胞可防止LPS 誘導的肺損傷，但抗 IL-4 阻斷抗體可以逆轉這種保護作用。但目前對IL-4 在ALI 中的作用機制尚無定論。本研究結果顯示，與ALI 模型組相比，IL-4 干預的各組ALI 細胞的凋亡率顯著降低，說明IL-4 對ALI 具有保護作用。除此之外，筆者還發現IL-4 濃度及其作用時間呈正相關。在本研究中，筆者也觀察到IL-4 處理后Caspase-3 表達下調及Bcl-2 表達上調。Caspase-3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其可以促進細胞凋亡，而Caspase-3 的作用可以被Bcl-2 阻斷；Bcl-2 可以抑制由多種細胞毒因素所引起的細胞死亡，其過度表達能增強細胞對多數細胞毒素的抵抗性。因此，筆者認為IL-4 在ALI 的發生發展中是保護性因素，其可以通過上調Bcl-2 表達，從而降低肺上皮細胞的凋亡，并改善其預后。

本研究檢測了經IL-4 處理后相關炎性細胞因子的變化情況，結果顯示，ALI 時促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌顯著升高，而抗炎細胞因子IL-10 在ALI 組分泌顯著降低，該結論與以往ALI 相關研究一致。而通過IL-4 干預后，實驗組的IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌顯著降低，其中TNF-α、TNF-γ 甚至可低于正常A549 細胞，且IL-10 分泌增加。Wehrmann F等[15]認為γδT 細胞可能通過調節肺中的TNFα 水平來限制巨噬細胞的擴增，進而抑制肺損傷。而Farivar 等[16]研究發現，在缺血再灌注肺損傷模型中，IL-4 與IL-10 可以協同降低IL-1β 和TNF-α 的水平，以達到減輕肺損傷的作用。有學者認為[17]，受損肺泡中的活化巨噬細胞、中性粒細胞和潛在的上皮細胞可以產生IL-6，后者可通過介導炎癥反應導致肺損傷。上述結論均支持本研究的結果，因此筆者推斷，IL-4 可能通過多種途徑抑制ALI 發生發展過程中的過度免疫反應，從而發揮其保護性作用。Pace L 等[18]的研究發現，IL-4 可促進Treg 細胞增殖，且Treg 細胞的免疫抑制能力增強。筆者推斷其可能的機制：IL-4 可阻止叉頭翼螺旋轉錄因子3（Forkhead Box P3，Foxp3）表達下調，而Foxp3 是Treg 細胞的特異標志物，并對其增殖和功能發揮起決定性作用。因而通過維持Foxp3 的表達，增強了Treg 細胞免疫調節功能[19?20]。

在ALI 的發生發展中，炎癥及抗炎反應占據核心地位，涉及多種復雜調節機制。本研究闡明急性肺損傷中IL-4 可能刺激相關炎性因子發揮正向調節作用，從而緩解急性肺損傷。但本研究目前僅限于體外實驗，其具體機制尚未完全闡明，仍需要后續動物實驗及基因、信號通路層面的研究驗證筆者的猜想。以期通過分子學的角度進行干預治療，提高急性肺損傷的治愈率。