HPLC 法測定通氣丸中3 種有效成份的含量

韓吳琦，方慧祥，呂晉*，黃永麗

1 河南省開封市食品藥品檢驗所，開封 475000；2 云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，曲靖 655000；3 河南大學淮河臨床學院，開封 475000

通氣丸是由青皮（醋炙）、陳皮、蒲公英、連翹、木香、甘草和乳香（麩炒）共7 味中藥材組成，具有益氣養血、行氣化瘀的功效［1］，用于產后氣血不足、虛中夾瘀、寒熱錯雜的脅腹脹痛、腹痛、頭身疼痛、惡露不絕、血暈昏迷、大便秘結、無乳等癥。方中青皮疏肝破氣，消積化滯；陳皮理氣健脾，燥濕化痰；連翹清熱解毒，消腫散結，疏散風熱［2］。該處方現行質量標準制定時間早，且僅有鑒別項而無其他測定指標，不能客觀全面反映通氣丸的質量。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了通氣丸中連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷的含量，以期為通氣丸的質量控制和標準修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 島津液相色譜儀（SIL-20A 自動進樣器、LC-20AT 泵、SPD-M20A230V 光電二極管陣列紫外可見光檢測器、CTO-20A 柱溫箱、DGU-20A5R 脫氣機、LCsolution 色譜工作站，日本島津制作所）；MS205DU 型電子天平（梅特勒—托利多公司）。

1.2 試藥

連翹酯苷A（批號：111810-201707，含量97.2%）、蕓香柚皮苷（批號：BW5225-2017030）、橙皮苷（批號：110721-201818，含量96.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；通氣丸（河南泰豐生物科技有限公司，規格：每袋裝9g，批號：20190301、201903031、20200301、20200302、20200303）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；磷酸（分析純，西亞化工試劑有限公司）；水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus-C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，比例為35∶65；檢測波長為283nm；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；進樣量為10μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取通氣丸適量，研細，取約0.4g，精密稱定后，轉移到帶塞的錐形瓶中。精密加入50ml 甲醇，稱定重量，超聲處理40min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm 的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷對照品適量，加甲醇制成含連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷分別為71.79、41.28、308.85μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備

按通氣丸的處方和制法分別制成缺連翹的陰性樣品和缺青皮、陳皮的陰性樣品，再按照“2.2.1”項下方法制成陰性對照品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項下的供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果表明，以混合對照溶液的色譜圖為參考，陰性對照品的色譜圖在對應位置無相應色譜峰，供試品溶液的色譜圖在對應位置有相應色譜峰，且相鄰色譜峰均能達到有效分離，其他成份對待測成份均無干擾。

圖1 混合對照品（A）、供試品（B）、缺連翹陰性樣品（C）和缺青皮、陳皮陰性樣品（D）的HPLC 圖

2.4 線性關系

取“2.2.2”項下混合對照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過。分別精密吸取2、4、6、8、10、20μl 濾液，按“2.1”項下色譜條件測定。以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。3 種成份在各自范圍內線性關系良好，詳見表1。

表1 3 種成份線性關系

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液10μl，按照“2.1”項下的色譜條件連續進樣6 次，測得連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為1.53%、1.74%、1.50%。表明本方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.1”項下的供試品溶液，分別在2、4、8、16、24、48h 進樣，按“2.1”項下的色譜條件測定峰面積。測得連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為0.28%、0.32%、0.15%。表明樣品溶液在48h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一樣品（批號：201903031）6 份，按“2.2.1”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件測定峰面積。測得樣品中連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷的平均含量分別為2.8537、2.4894、7.1189mg/g，RSD 分別為0.65%、0.48%和0.52%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：201903031）6 份，每份約0.2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中。分別精密加入連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷對照品0.4307、0.2477、1.8531mg，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進行測定并計算回收率，其結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.9 樣品含量測定

取5 批樣品，按“2.2.1”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測定，以峰面積計算含量，結果見表3。

表3 通氣丸中3 種成份的含量測定結果 mg/g

3 討論

3.1 測定指標的選擇

通氣丸中，青皮、陳皮為君藥，蒲公英為臣藥，連翹、木香、乳香為佐藥，甘草為使藥。君藥主要用于治療產后因氣血不足、虛中夾瘀、寒熱錯雜造成的脅腹脹痛、腹痛、頭身疼痛等；佐藥連翹主要佐助君藥發揮治療作用和治療次要兼證［3］。青皮（醋炙）味苦、辛，溫，入肝經，可疏肝破氣；陳皮味苦、辛，溫，歸肺、脾經，可理氣調中。二者主要活性成份分別為橙皮苷和蕓香柚皮苷［4］；佐藥連翹中的主要活性成份為連翹酯苷A。橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調節免疫力、防輻射、保護心血管系統等［5］藥理活性；蕓香柚皮苷和橙皮苷配伍給藥可明顯促進正常小鼠的小腸推進［6］；連翹酯苷A 可抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性，從而減少乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）的水解而使其堆積，發揮擬膽堿作用［7-8］。ACh 為膽堿能興奮性神經遞質，能使胃腸平滑肌收縮張力和振幅升高［9］。三者均可促進胃腸推進收縮和產后排氣，因此本研究選取橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 作為通氣丸的質量控制指標。

3.2 檢測波長的選擇

在200~400nm 范圍內對混合對照品溶液進行紫外掃描。結果表明，橙皮苷、蕓香柚皮苷、連翹酯苷A 分別在283.6、282.4、291.0nm 波長處有最大吸收，參照2020 年版《中國藥典》［2］及相關文獻［10-12］，本研究選擇283nm 作為檢測波長。

3.3 提取方法的選擇

基于橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 的理化性質，本實驗分別以50%、75%、100%甲醇為溶劑進行提取，考察不同時間（30、45、60min）和不同方式（超聲、回流）處理樣品后對3 種成份含量的影響［10-12］。結果表明，以純甲醇為提取溶劑時，超聲45min 后提取效果最佳，且耗時短、操作簡單、便捷。

3.4 流動相的選擇

本實驗考察了不同比例的甲醇-乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動相系統［13］，并采取等度洗脫、梯度洗脫進行試驗。結果表明，以甲醇-0.1%磷酸溶液（35∶65）為流動相的色譜圖基線平穩，各組份峰形和分離效果均良好，因此確定其為流動相。

3.5 含量測定結果分析

不同批次通氣丸中3 種成份的含量存在一定差異，這可能與處方中各組份的產地、采收季節、炮制方法、提取方法以及制劑的生產過程等多種因素有關。為了達到中藥復方制劑質量的一致性，建議藥品生產企業除了控制制劑的生產過程外，還要加強把控藥材的來源、種植方式、采收、加工與炮制等環節，保證入藥品種的質量。

通氣丸的現行質量標準尚未規定處方中各組份含量，難以體現樣品中有效成份的整體變化情況，也難以保證中藥藥效物質基礎的有效傳遞。多指標成份含量測定的控制模式可實現對多個成份的同時把關和對產品質量的精確控制，能有效反映中藥制劑的有效性和穩定性?；诖耍狙芯拷⒌姆椒赏瑫r測定通氣丸中3 種活性成份的含量，對通氣丸生產工藝的規范、優化和質量控制有一定指導作用，可作為其質量評價的有效方法。

綜上，本實驗所建立的檢測方法簡便、快速、靈敏度高，可對通氣丸中橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 進行定量測定，為完善通氣丸的質量標準提供了一定的參考。