蜂蜜中苦參堿與氧化苦參堿的快速檢測

荊輝華 向 俊，2 蔣登輝 馮燕英 王云昊 王亮亮

(1. 湖南省產商品質量檢驗研究院食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410017；2. 中南大學化學化工學院，湖南 長沙 410083；3. 長沙理工大學物理與電子科學學院柔性電子材料基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410114)

苦參堿和氧化苦參堿主要從豆科植物苦參中提取，因具有消炎、抗病毒、抗過敏、抗心律失常等作用，常被應用于藥學和醫學領域[1-3]。在病蟲防治方面，苦參堿和氧化苦參堿是一類植物生物堿殺蟲劑，具有觸殺、胃毒作用，對人畜低毒[4]。苦參堿在中國被允許用于柑橘、仁果類水果以及瓜類、蕓薹屬類蔬菜，是一種新型的相對安全的生物農藥，但近一年來，歐盟國家曾多次通報中國出口蜂蜜中檢出氧化苦參堿，產品被拒絕入境。根據歐盟(EC)第396/2005號規定，對于未經批準的物質，其最大殘留限度一律設為10 μg/kg。據相關研究[5-7]顯示，苦參堿與氧化苦參堿是天然植物內源性成分，在與苦參同屬豆科槐屬植物中廣泛存在，如中國西北地區廣泛分布的狼牙刺、西藏地區的砂生槐等蜜源植物均含有高含量的苦參堿與氧化苦參堿，因此部分蜂蜜中的苦參堿和氧化苦參堿可能是一種內源性成分而非農藥殘留。

目前，關于苦參堿和氧化苦參堿的檢測方法研究多集中于其作為含量較高的原料和藥物使用方面，如苦參作物[8-9]、中藥飲片[10]、復方苦參湯[11]、抗婦炎膠囊[12]等，主要有液相色譜法和液相色譜—質譜法。在作為生物農藥使用方面，可采用液相色譜串接質譜儀測定有機茶葉、蔬菜、水果、魚肉及土壤中苦參堿和氧化苦參堿含量[13-16]，相比于液相色譜法，高效液相色譜—質譜聯用法靈敏度高，抗干擾能力強，更適用于蜂蜜中低含量的內源性成分[17]、生物農藥等目標物的檢測。目前，關于蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿檢測的研究尚未見報道。

研究擬采用液液萃取結合超高效液相—串聯質譜法建立一種蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿含量的檢測方法，為蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的風險評估提供依據，為中國蜂蜜質量安全提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；

氨水、乙酸銨、氯化鈉、無水硫酸鎂：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

無水硫酸鈉：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

苦參堿(CAS號519-02-8，純度99.87%)、氧化苦參堿(CAS號16837-52-8，純度98.94%)標準品：北京壇墨質檢科技股份有限公司；

蜂蜜：共45種，根據名稱及蜜源進行分類，其中百花蜜13種，洋槐蜜11種，土蜂蜜8種，枇杷蜜3種，椴樹蜜2種，柑橘蜜2種，紫云英蜜2種，野菊花蜜2種，荊條蜜1種，山烏桕蜜1種，市售。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜—串聯質譜儀：Waters Xevo TQ-S micro型，美國Waters公司；

電子分析天平：BSA224s型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

高速離心機：TG16-WS型，長沙市湘儀儀器有限公司；

多管旋渦混合器：945066 數顯型，美國Talboys公司；

多通道平行濃縮儀：M64型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

超純水機制備系統：Milli-Q型，美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 蜂蜜攪拌均勻，取試樣1.00 g于15 mL 離心管中，加入3 mL超純水渦旋振蕩使蜂蜜充分溶解，加入6.0 mL 0.1%氨水—乙腈，加入無水硫酸鈉1.5 g，渦旋振蕩5 min，使0.1%氨水—乙腈與樣品溶液充分萃取，10 000 r/min離心5 min，準確吸取3.0 mL上清液氮吹至近干，90%乙腈/水溶液(含0.1%甲酸)定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，上機測試。

1.3.2 標準溶液的配制

(1) 標準儲備溶液：準確稱取一定量的苦參堿和氧化苦參堿標準品用甲醇溶解，分別配制成1 000 μg/mL標準儲備溶液，再準確量取一定量的1 000 μg/mL標準溶液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的中間液，再將10 μg/mL的中間液稀釋成1 μg/mL的混合標準使用溶液，于4 ℃冷藏保存。

(2) 純溶劑標準溶液：分別移取一定體積的1 μg/mL的混合標準使用溶液，用90%的乙腈/水溶液(含0.1%甲酸)定容，配制質量濃度分別為1，5，10，20，50，80，100 ng/mL 的標準工作液。

(3) 基質標準溶液：用空白基質蜂蜜樣品按前處理制得空白基質溶液，采用空白基質溶液配制成1，5，10，20，50，80，100 ng/mL的基質匹配標準工作液。

1.3.3 質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式掃描；離子源溫度150 ℃；噴霧電壓2.0 kV；多重反應監測模式(MRM)；加熱氣溫度500 ℃；脫溶劑氣1 000 L/h；苦參堿、氧化苦參堿特征離子對及碰撞能量參數見表 1，選用信號較高的離子為定量離子對，苦參堿的定量離子對為249.2>148.2，定性離子對為249.2>110.2，氧化苦參堿的定量離子對為265.2>205.2，定性離子對為265.2>148.2。

表1 苦參堿和氧化苦參堿的質譜參數?Table 1 Mass parameters for matrine and oxymatrine

1.3.4 色譜條件 Inspire HILIC色譜柱(150 mm×2.1 mm×3 μm)；流動相A相為0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液，B相為乙腈；柱溫35 ℃；進樣量5.0 μL；梯度洗脫程序：0～2.0 min，10% A；2.0～3.0 min，10%～80% A；3.0～6.0 min，80% A；6.0～6.5 min，80%～10% A；6.5～10.0 min，10% A。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

2.1.1 質譜條件 結果顯示，正離子模式(ESI+)下，合成了準分子離子[M+H]+，苦參堿和氧化苦參堿的響應靈敏度高，通過改變碰撞能量可觀察到信號較強的子離子，故采用MRM模式，對確定的子離子的碰撞能進行優化，以獲得最佳的質譜參數。

2.1.2 色譜柱選擇 結果顯示C18柱中，需要較高比例的水相才能獲得一定的保留，然而較高比例的水相不利于樣品雜質組分的分離和洗脫，同時高比例水相不利于目標物蒸發電離，導致目標物的ESI-MS靈敏度下降。HILIC色譜柱采用極性較強的固定相，提高了極性化合物的保留，采用HILIC色譜柱測定苦參堿和氧化苦參堿，獲得了滿意的保留效果，且目標物峰型較好，因此選擇HILIC柱為分離色譜柱。

2.1.3 色譜條件 結果顯示，在0.1%甲酸中，目標物峰嚴重拖尾，且響應信號低。在0.1%甲酸中加入5 mmol/L的乙酸銨，峰型可得到明顯改善，且響應信號增強，可能由于生物堿測定中堿基與色譜柱中陰離子硅醇官能團相互作用導致的拖尾效應[14]，加入緩沖鹽可降低其相互作用，明顯改善目標化合物峰型。故采用0.1%甲酸—5 mmol/L 乙酸銨緩沖液和乙腈進行梯度洗脫，并在10 min 內完成單個樣品的分析測試，采用優化好的色譜條件，樣品基質對目標物檢測干擾小，峰型良好，標準品、陽性樣品及陰性樣品的MRM圖譜見圖1。

圖1 標準溶液、不同樣品的MRM色譜圖Figure 1 MRM chromatograms of the standard solution and different sample solution

2.2 提取條件優化

2.2.1 提取溶劑和鹽析劑 液液萃取中，常用的萃取溶劑有正己烷、乙酸乙酯、乙腈等，正己烷和乙酸乙酯的極性較弱，對極性化合物的提取效果較差，乙腈對極性或非極性化合物的提取率較高，乙腈雖能與水互溶，但在水相體系中加入適量鹽就能促使乙腈與水分離，使得目標物被富集于乙腈層中。根據苦參堿和氧化苦參堿易溶于極性溶劑的性質，選用乙腈體系作為萃取溶劑。

蜂蜜中含果糖和葡萄糖，在一定濃度下，其本身也能促使乙腈和水分離[18]，因此，蜂蜜水—乙腈體系在不加鹽的情況下也能相分離?？疾鞜o鹽、NaCl、Na2SO4、MgSO4、QuEChERS試劑(4 g無水 MgSO4、1 g NaCl、0.5 g 檸檬酸氫二鈉和1 g檸檬酸鈉)對回收率的影響，結果見表2。若直接采用乙腈萃取，苦參堿和氧化苦參堿的回收率較低，由表2可知，除加入QuEChERS鹽析劑后目標物的回收率分別為56.7%，54.4%外，其他幾種鹽析劑的回收率未超過50%。采用酸性乙腈提取時，加入MgSO4的回收率最高，其中苦參堿和氧化苦參堿的回收率分別為78.3%，76.0%。采用堿性乙腈提取時，苦參堿的回收率明顯升高，未加鹽和不同鹽析劑下的回收率均>80%，其中Na2SO4的回收率最高達99.1%。鹽析劑種類對苦參堿的影響較小，但對氧化苦參堿的影響較大。不加鹽情況下氧化苦參堿回收率為35.9%，加入NaCl后回收率降低，可能是NaCl抑制氧化苦參堿從水相中轉移至乙腈中，其他幾種鹽的回收率依次為Na2SO4>MgSO4>QuEChERS，Na2SO4的回收率達83.0%?？鄥A和氧化苦參堿為堿性化合物，萃取溶劑中加入堿能促使目標物化合物以分子形式存在，增加其在乙腈中的溶解度，從而提高回收率。比較0.1%，0.2%，0.5%，1.0%，2.0%氨水—乙腈對目標物提取效果的影響，發現氨水濃度對回收率無顯著影響，綜合考慮，以0.1%氨水—乙腈作為萃取溶劑，并采用Na2SO4作為鹽析劑。

表2 不同萃取體系及鹽種類的回收率Table 2 Recoveries of different extraction systems and salt species %

2.2.2 蜂蜜質量與加水量 蜂蜜含糖量一般為60%～80%，黏稠度較大。如直接用有機試劑提取，提取樣品易呈現膠質狀，目標物可能會被蜂蜜中糖分吸附，進而導致提取效果較差[19]，故先用適量水溶解蜂蜜，使其成為均相體系。為保證試驗參數一致，增加水量同時增加溶劑用量。由圖2可知，加水稀釋影響目標物的提取，其中對氧化苦參堿的影響大于苦參堿，當m蜂蜜∶V水<1∶3 (g/mL)時，樣品中氧化苦參堿的回收率較低，繼續加大水量，二者回收率均降低。加水量過多，目標物在水中溶解量增加難以萃取完全。因此，采用1 g蜂蜜加3 mL水進行溶解。

圖2 蜂蜜質量與加水體積比例對回收率的影響Figure 2 Recoveries of different proportions of honey mass and water volume

2.2.3 萃取溶劑用量 由圖3可知，隨著萃取溶劑用量的提高，回收率增加，當萃取溶劑用量為6 mL時，回收率無明顯增加，且溶劑用量繼續提高會增加糖在萃取劑乙腈中溶解，故采用6 mL 0.1%氨水—乙腈進行萃取。

圖3 萃取劑用量對回收率的影響Figure 3 Recoveries of different amounts of extraction solvent

2.2.4 鹽析劑用量 由圖4可知，隨著Na2SO4用量的增加，回收率提高，當Na2SO4加入量>1.5 g時，二者回收率無明顯增加，故鹽析劑用量選1.5 g。

圖4 鹽析劑用量對回收率的影響Figure 4 Recoveries of different amounts of salting-out agent

2.3 基質效應

基質效應采用基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率評估[20]，基質效應<100%表明存在基質抑制，基質效應>100%表明存在基質增強，基質效應為80%～120%，通常認定基質效應對定量檢測的影響可被接受。由表3可知，苦參堿和氧化苦參堿的基質效應分別為91.5%，89.9%，均存在一定的基質抑制，但處于可被接受的范圍內，常規檢測可采用溶劑配制標準工作曲線進行定量分析。同時，試驗發現流動相的組成和比例對基質效應有影響，適當提高溶劑極性，如適當提高流動相中水相比例能一定程度降低基質干擾，后續可考慮優化流動相比例降低基質效應的影響。這可能由于樣品中某些極性化合物與目標物出峰時間相近，干擾目標物電離，適當提高水相比例，有助于雜質與目標物的分離，降低了其對樣品分析的干擾。

表3 蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的基質效應Table 3 Matrix effects of matrine and oxymatrine in honey

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系、檢出限和定量限 由表4可知，苦參堿和氧化苦參堿的線性關系良好，相關系數均達到0.999以上，符合定量要求，定量限為0.3 μg/kg。

表4 標準曲線方程、相關系數、檢出限和定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients (R2) and LODs and LOQs of analytes

2.4.2 回收率和精密度 由表5可知，苦參堿的加標回收率為90.9%～95.1%，相對標準偏差為2.98%～6.78%，氧化苦參堿的回收率為80.9%～84.3%，相對標準偏差為4.45%～5.06%，平均回收率和RSD均符合GB/T 27404—2008附錄F的要求，說明該方法的準確性和重復性良好。

表5 陰性蜂蜜樣品的加標回收率和相對標準偏差Table 5 Spiked recoveries and RSD of analytes in blank honey (n=6)

2.5 實際樣品測定

采用試驗建立的定性和定量分析方法對收集到的45批次蜂蜜進行測定，結果見表6。由表6可知，同一樣品中一般苦參堿和氧化苦參堿同時檢出，土蜂蜜和百花蜂蜜雖有檢出，但含量較低，其中洋槐蜜11份，檢出7份，檢出率為63.6%，且檢出樣品的含量相對較高，苦參堿含量最高達58.40 μg/kg，氧化苦參堿含量最高達93.17 μg/kg，考慮內源性成分可能性大，因為狼牙刺、砂生槐類植物中含苦參堿和氧化苦參堿[6-7]，洋槐與這兩類植物同屬豆科植物，花期和地理分布相近，洋槐蜜源容易遭受狼牙刺、砂生槐蜜源的影響，導致洋槐蜜中檢出苦參堿和氧化苦參堿。

3 結論

建立了液液萃取結合UPLC-MS/MS檢測蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的分析方法。結果表明，該方法前處理簡單，靈敏度高，回收率穩定，將該方法用于市售蜂蜜的測定，成功檢測出蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿含量，方法可靠性高，快速準確，適用于蜂蜜樣品的批量檢測，可以成為蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿殘留的常規檢測技術。如何進一步提高氧化苦參堿的回收率是值得研究的問題，同時，后期將增加樣本的種類和數量，系統地研究苦參堿、氧化苦參堿與蜜源的關系，為蜂蜜中苦參堿和氧化苦參堿的風險評估提供更為充分的依據。

表6 蜂蜜樣品中苦參堿和氧化苦參堿含量分布?Table 6 Distribution of matrine and oxymatrine contents in different honey samples