微小RNA-9在子宮內膜癌組織中表達及意義

陳小霞，謝環，李曉蘭

作者單位：三峽大學宜昌市第二人民醫院婦產科，湖北 宜昌 443000

子宮內膜癌發病率呈上升趨勢、發病年齡出現年輕化［1］，對女性生命安全構成了嚴重威脅。盡管現有的臨床診療手段不斷進步，早期子宮內膜癌病人經規范化治療后，總體生存期不斷延長［2］，但對于進展期或轉移復發的病人，預后依然較差，病死率較高［3］。因此，積極探討影響子宮內膜癌發生、進展的早期標志物，對該腫瘤早期診療及預后改善具有重要意義。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一種在轉錄后水平通過與mRNA 靶序列結合而實現對靶基因的負性調控的非編碼RNA，可在多種生理、病理過程中發揮重要作用［4］。近年來發現［5］，miRNA 與多種惡性腫瘤發生及進展密切相關。有研究指出［6］，子宮內膜癌干細胞分化過程中部分miRNA的表達具有顯著性變化。miR-9 作為一種miRNA，可在體內多種組織中表達并發揮重要作用［7］。本研究檢測了miR-9 在子宮內膜癌組織中表達情況，分析了與臨床病理指標及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012 年4 月至2014 年4 月在三峽大學宜昌市第二人民醫院行手術治療的子宮內膜癌病人，納入標準：術前未接受放化療、內分泌治療；術后病理明確為子宮內膜癌；術前無內分泌、免疫、代謝性疾病；未失訪，資料完善。排除標準：轉移性子宮內膜癌；合并有其他惡性腫瘤。共納入97例，年齡（54.67±9.67）歲，范圍為34～73歲。體重指數（BMI）（25.35±2.67）kg/m2，按照國際婦產科聯盟（FIGO）2009 年標準：Ⅰ～Ⅱ期56 例，Ⅲ～Ⅳ期41例；36 例出現淋巴結轉移。同期，留取因子宮肌瘤、脫垂等良性病變行子宮切除手術的正常子宮內膜組織46 份，年齡（55.39±10.15）歲，范圍為32～74歲。本研究通過宜昌市第二人民醫院醫院倫理委員 會 批 準（ 批 準 文 號 ：HBSYCSDERMYY201108061136），所有病人均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 術 用外科剪將子宮內膜癌及正常子宮內膜組織剪碎，加入組織研磨機勻漿，按Trizol總RNA 提取試劑說明（購自美國Invitrogen 公司）提取總RNA。利用紫外分光光度計檢測總RNA 濃度和純度，合格標準：OD260/OD280在1.80～2.20。按照逆轉錄試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）說明將總RNA 逆轉錄為cDNA，根據PCR 擴增試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）操作步驟，用CFX96 型實時熒光定量PCR 儀（購自美國Bio-Rad 公司）對引物序列進行擴增，引物序列：miR-9 正向5’-GCGCGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATG-3’，反向5’-GCTGTCAACGATACGCTACG-3’；U6 正向5’-CTGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。反應條件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，73 ℃30 s，循環38 次。采用2-ΔΔCt法計算組織中miR-9相對表達量。

1.2.2 隨訪 術后第1天開始，對病人進行隨訪，包括門診、電話等，隨訪至2019 年4 月30 日，隨訪2～84個月，記錄病人死亡情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件，計量資料采用±s，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-Rank 檢驗，多因素因素分析采用Cox 比例風險回歸模型，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌及正常子宮內膜組織中miR-9 表達比較 miR-9 在子宮內膜癌組織相對表達量為（0.25±0.10），在正常子宮內膜組織中則為（1.02±0.14），差異有統計學意義（t=38.42，P＜0.001）。

2.2 不同臨床病理指標的子宮內膜癌組織中miR-9 表達比較 相比于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、組織學分級G1～G2 期、浸潤深度＜1/2 肌層、未淋巴結轉移，miR-9相對表達量在Ⅲ～Ⅳ期、G3期、≥1/2肌層、淋巴結轉移顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 子宮內膜癌病人不同臨床病理指標中miR-9表達比較/±s

表1 子宮內膜癌病人不同臨床病理指標中miR-9表達比較/±s

指標年齡＜55歲≥55歲是否絕經例數miR-9相對表達量t值1.36 P值0.177 43 54 0.23±0.10 0.26±0.10 1.82 0.073是否40 57 0.23±0.09 0.26±0.10病理學類型子宮內膜腺癌非子宮內膜腺癌FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期組織學分級G1～G2期G3期浸潤深度＜1/2肌層≥1/2肌層雌激素受體陽性陰性孕激素受體陽性陰性淋巴結轉移1.44 0.154 77 20 0.25±0.10 0.22±0.08 3.84＜0.001 56 41 0.28±0.10 0.20±0.09 3.76＜0.001 59 38 0.28±0.10 0.20±0.08 3.89＜0.001 55 42 0.28±0.10 0.21±0.09 1.63 0.106 66 31 0.26±0.10 0.22±0.10 1.78 0.078 61 36 0.23±0.10 0.27±0.10 3.46 0.001是否36 61 0.20±0.08 0.27±0.10

2.3 miR-9 表達對子宮內膜癌病人生存時間的影響 選取miR-9 相對表達量的P25值（0.16），病人分成低表達組（＜0.16）16 例及高表達組（≥0.16）71 例，生存分析示，低表達組生存時間低于高表達組［（34.82±5.96）個月比（69.23±3.12）個月］，累積生存率低于高表達組（24.00% 比75.00%），差異有統計學意義（χ2=28.37，P＜0.001）。

2.4 影響病人預后的因素 FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度≥1/2 肌層、淋巴結轉移和miR-9 低表達是病人預后的風險因素（HR=2.44、2.75、2.26 和0.31，P＜0.05）。

表2 子宮內膜癌97例預后影響因素的Cox比例風險回歸模型

3 討論

子宮內膜癌誘發因素較多，發病率僅次于宮頸癌，位女性生殖道惡性腫瘤第二位［8］。臨床上對于早期子宮內膜癌病人的治療主要以手術切除輔以放化療，多數病人病情得到很好控制，5 年生存率不斷提高［9］，但對于晚期及發生復發轉移的病人，死亡率較高，5 年生存率不超過30%［10］。目前，對于子宮內膜癌發生、進展機制及診療標志物研究尚處于起步階段，積極尋找有效的分子標志物或靶基因對明確子宮內膜癌發生、進展機制及診療具有重要意義。有研究指出，miRNAs 功能及表達異常與人類腫瘤發生、進展密切相關［11］。miRNAs 可在腫瘤發生中起促癌或抑癌基因功能［12］。有研究指出，miRNAs 基因譜在子宮內膜癌組織中出現異常［13］。miR-9 是近年來被發現在多種惡性腫瘤組織中表達異常的miRNA［7］，且在不同類型的惡性腫瘤中既可以扮演癌基因的作用而促進腫瘤發生及血管生成［14］，又可以作為抑癌基因參與腫瘤細胞增殖和運動［15］。本研究中，miR-9 在子宮內膜癌組織中相對表達量顯著降低，提示可能發揮抑癌基因參與了子宮內膜癌發生。本研究中，相比于FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、組織學分級G1～G2 期、浸潤深度＜1/2 肌層、未淋巴結轉移，miR-9 相對表達量在Ⅲ-Ⅳ期、G3 期、≥1/2 肌層、淋巴結轉移顯著降低，說明隨著子宮內膜癌惡性程度增加，miR-9 表達量降低，提示miR-9 低表達可能參與了子宮內膜癌惡性化過程。

有研究指出，miR-9 低表達與結直腸癌病人不良預后相關，是影響病人預后的因素［16］。亦有研究指出，miR-9 是膀胱癌切除術后病人預后的影響因素［17］。本研究結果表明，低表達組生存時間和累積生存率均低于高表達組，說明提示miR-9 表達水平與病人預后有關。本研究結果進一步表明，miR-9低表達是病人預后的風險因素，可能是病人預后評估的潛在標志物。

綜上所述，miR-9 在子宮內膜癌組織中低表達，且是病人預后的風險指標，但其作用的分子機制尚需開展研究明確。