白藜蘆醇對維甲酸治療髓母細胞瘤的增敏作用及機制研究*

李晴晴 黃 菊 張小鳳 王月月 聶文虎 耿志軍 鮑云溪 宋 雪

1 蚌埠醫學院第一附屬醫院中心實驗室，安徽省蚌埠市 233004；2 蚌埠醫學院科研中心組織移植安徽省重點實驗室； 3 蚌埠醫學院第一附屬醫院檢驗科

髓母細胞瘤(Medulloblastoma，MB)是顱內膠質瘤的一種，惡性程度最高，多發于14歲以下的青少年，是死亡率較高的一類惡性腫瘤[1]。全反式維甲酸(Retinoic acid，RA)因其生物利用度高、低毒性而更適宜于兒童髓母細胞瘤的治療，但部分MB卻存在對RA敏感性不佳的問題[2]。根據生物學及遺傳學的異質性，MB分為具有明顯特征性基因變化的4個亞型：SHH型、WNT型、G3型和G4型，其中G3型惡性程度最高，對抗腫瘤藥物的敏感差，易導致患者預后不佳[3-4]。研究發現甲基化抑制劑5-氮胞苷可以改善MB的腫瘤細胞對RA的敏感性[5]。傳統的甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷由于毒性較強而不適宜于兒童髓母細胞瘤的治療[6]。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種生物學活性[7-8]。研究發現Res在極低的藥物濃度下仍對抑癌基因有較強的去甲基化作用[9]。在此基礎上，本研究通過離體與在體實驗相結合，證實Res是否通過提升MB對RA的藥物敏感性，并揭示Res影響RA藥物敏感性的調控機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養及處理 以每毫升5.0×104個細胞的濃度在培養皿中(100mm)分別接種Med-3、UW228-2、UW228-3細胞，當細胞生長至對數期時，棄去原有的培養液，更換10ml新鮮培養液，同時按照分組加入相應濃度的藥物，Res(Sigma,Cat#∶R5010)：25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L；RA(Sigma，Cat#∶R2625)：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L；Res與RA；正常培養的細胞設為對照組(Control組)；輕輕搖勻后置于孵箱中培養。藥物持續作用72h后，收集各組細胞于Ep管中并保存在-80℃冰箱中。

1.2 MTT 通過3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-四唑溴化物(MTT，Sigma，Cat#∶CT02)測定來確定藥物對細胞增殖的影響。處理后的細胞與MTT共孵育3h，使用DMSO(Sigma，Cat#∶D2650)溶解，酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其OD值。

1.3 HE染色 利用細胞爬片或組織切片進行HE染色，蘇木素染核5min，自來水洗滌；然后進行分化數秒，自來水洗滌；再用伊紅染細胞質5min，自來水洗滌，脫水固定。使用中性樹膠封片，自然晾干后使用顯微鏡觀察腫瘤細胞的形態和數量變化。

1.4 TUNEL檢測 根據標準方案脫蠟并水化組織切片，將載玻片置于含有檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的塑料盒中，施加350W微波輻射5min。采用PBS沖洗載玻片2次，待樣品周圍干燥，在樣品上加入50μl TUNEL反應混合物(Roche，Cat#∶11684795910)，37℃避光孵育60min，注意保持載玻片的濕潤。用PBS沖洗載玻片2次，滴加DAPI染色，在熒光顯微鏡下分析樣品。

1.5 動物模型 利用腦定位儀和顱骨鉆機在裸鼠顱骨垂直打孔(矢狀縫右側2mm，人字縫后2mm)，將UW228-2細胞(1×106個)移植入裸鼠的小腦右側半球，構建裸鼠髓母細胞瘤原位移植模型。通過腹腔給藥：對照組(等量生理鹽水)、Res單獨給藥組(300μmol/L，0.1ml)和RA單獨給藥組(100μmol/L，0.1ml)及Res與RA聯合給藥組，聯合給藥的順序為：先進行腹腔注射RA，5min后再給予Res。2d給藥1次，持續3周。在模型鼠出現發病特征(體重減輕，食欲不振，眼鼻黏膜出血，偏行或癱瘓)后密切觀察，于瀕死狀態立即麻醉、脫頸處死裸鼠，記錄生存時間。收集新鮮的組織樣本，一部分液氮(<-180℃)凍存以制備蛋白、DNA、RNA，剩余部分保存于4%福爾馬林溶液中，靜置過夜。

1.6 MRI 在細胞植入裸鼠小腦半球后的第2天進行MRI監測以明確腫瘤細胞在裸鼠顱內的成瘤時間。待成瘤后將模型鼠平均隨機分為四組：正常組(不進行任何處理)、Res治療組、RA治療組、Res聯合RA治療組。治療干預后的第3天繼續進行MRI成像監測(Bruker BioSpin MRI GmbH)，并PS軟件測算腫瘤的最大橫截面積。

1.7 免疫組化 對裸鼠原位瘤腦組織進行免疫組織化學染色，使用Ki-67抗體(1∶100；Abcam，Cat#∶ab16667)以確定腫瘤細胞內的增殖活性。經過二甲苯脫蠟、抗原修復、孵育一抗過夜、二抗孵育、DAB顯色、染核、封片一系列操作，最后在顯微鏡下讀片分析結果。

1.8 Western blot Western blot 用于檢測腫瘤細胞內的CRABP2及RAR/RXR蛋白水平的變化和凋亡信號通路的活化程度。使用的一抗為Bax、Bcl2、caspase3、c-caspase3、CRABP2、RAR/RXR和β-actin(Abcam；1∶100；Cat#∶ab 243140；ab 32124；ab 32351；ab 32150；ab 181255；ab 231610；ab 8226),稀釋比例為1∶800。

1.9 RT-qPCR RT-qPCR分析腫瘤組織的維甲酸代謝通路，提取腫瘤中的總RNA，通過擴增CRABP2、RAR/RXR的相關引物,評估其mRNA水平的變化。引物序列見表1。

表1 引物序列(5’to 3’)

1.10 統計學方法 通過SPSS17.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL)分析實驗數據。通過獨立樣本t檢驗評估兩組數據的統計學差異，并通過χ2檢驗評估分類數據。P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 體外研究

2.1.1 在體外白藜蘆醇能夠增強髓母細胞瘤對維甲酸的敏感性，抑制細胞增殖活性：MTT結果顯示，經濃度10μmol/L的RA處理，Med-3細胞系顯示其本身就對RA具有高敏感性。在此濃度下，Med-3細胞的增殖活性降低，細胞數量相較對照組明顯減少(P<0.05)。而UW228-2、UW228-3細胞系在此濃度下(RA 10μmol/L)表現出對RA的低敏感性，細胞數量與對照組無明顯差異(P>0.05)。但是三種細胞系經Res和RA聯合給藥處理后，細胞數量相對于單獨給藥組明顯減少(P<0.05)，這表明Res可能增強了MB對RA的敏感性，抑制細胞增殖活性(圖1a～c)。為了進一步論證此結論，我們選取對照組、單獨給藥組Res(12.5μmol/L)、RA(5μmol/L)以及Res與RA聯合給藥組的細胞爬片進行HE染色，結果顯示聯合給藥組與對照組相比腫瘤細胞的形態發生神經元樣改變，細胞數量顯著減少(P<0.05)，見圖1d。以上結果均表明Res能夠明顯增強MB對RA的敏感性，抑制細胞增殖活性，有效減少了細胞數量。

圖1 白藜蘆醇增強髓母細胞瘤對維甲酸的敏感性

2.1.2 在體外白藜蘆醇能夠增強維甲酸誘導的細胞凋亡：為了驗證Res能否增強RA誘導的腫瘤細胞凋亡，選取對照組、Res(12.5μmol/L)、RA(5μmol/L)和Res與RA聯合給藥組處理過的MB細胞系(Med-3、UW228-2、UW228-3)進行TUNEL檢測，結果顯示單獨給藥處理組腫瘤細胞的凋亡數量較少，而聯合給藥組的腫瘤細胞凋亡數量顯著增多(P<0.05)，此結果表明Res能夠增強RA誘導的細胞凋亡(見圖2)。后續實驗考慮到低濃度Res對UW228-2細胞的增敏作用已然最佳，特選取低濃度Res和RA作為重點研究對象。這些實驗結果都證明了Res與RA聯合給藥處理可明顯誘導MB的凋亡。

2.1.3 白藜蘆醇和維甲酸聯合給藥能夠激活凋亡通路：為了探究Res是如何增強RA誘導的細胞凋亡，我們提取了藥物處理后的細胞，利用Westerrn Blot檢測細胞內凋亡信號通路的改變。選取MB細胞系(UW228-2)為重點研究對象，以β-actin為內參檢測Bax、Bcl2、c-caspase3和caspase3蛋白。結果顯示對照組與單獨給藥組的抗凋亡蛋白Bax表達量無明顯差異(P>0.05)，而聯合給藥組的Bax蛋白表達量明顯增加(P<0.05)，約為其他組的2.6倍；對于抗凋亡蛋白Bcl2的檢測結果顯示對照組與單獨給藥組的表達量無明顯差異(P>0.05)，而聯合給藥組的表達量相對于其他組卻顯著降低(P<0.05)；另外，對照組和聯合給藥組的c-caspase3蛋白表達量無明顯差異(P>0.05)，相對于聯合給藥組表達量明顯降低，而聯合給藥組的c-caspase3蛋白表達量卻顯著上調(P<0.05)，見圖3。以上結果均表明Res與RA聯合給藥能夠激活凋亡通路，進而增強RA誘導的細胞凋亡。

圖3 聯合給藥激活凋亡通路

2.1.4 白藜蘆醇通過激活RA代謝通路增強維甲酸敏感性：我們的研究表明在體外Res與RA聯合給藥能夠激活凋亡通路，那么Res是否凋亡激活RA代謝通路來增強其對RA的敏感性？于是我們通過Western Blot和RT-qPCR檢測腫瘤細胞內的CRABP2及RAR/RXR的變化。Western Blot結果顯示對照組與RA組相比，腫瘤細胞內的CRABP2表達無明顯差異(P>0.05)，而Res組與聯合給藥組相比，CRABP2的表達雖無明顯差異(P>0.05)，但這兩組比對照組和RA組的CRABP2蛋白表達量增加(P<0.05)，這提示Res能夠激活RA代謝通路(圖4a～b)。此外，Western Blot檢測結果還顯示對照組與RA組細胞內的RAR/RXR表達量無明顯差異(P>0.05)，而Res組和聯合給藥組與其他兩組相比RAR/RXR的表達量均顯著增多(P<0.05)，此結果提示Res增強了腫瘤細胞對RA的敏感性(圖4c)。為了進一步證明此結論，我們進行RT-qPCR檢測CRABP2及RAR/RXR的mRNA水平，其結果驗證了Western Blot的趨勢(圖4d～e)。以上結果均表明在體外Res通過激活RA代謝通路增強RA敏感性。

2.2 體內研究

2.2.1 聯合給藥抑制了裸鼠顱內腫瘤的生長并延長生存時間：體外細胞實驗結果已證明Res可能通過激活RA代謝通路增強RA敏感性，進而抑制細胞活性，減少了細胞腫瘤細胞數量。因此，我們構建裸鼠原位瘤模型來進一步證明Res對RA具有增敏作用。建模10d后對裸鼠的腦部進行核磁共振掃描，結果顯示對照組、Res組和RA組小鼠的顱內腫瘤面積無明顯差異(P>0.05)；而聯合給藥組腫瘤面積相對于其他組裸鼠顱內腫瘤生長較慢，腫瘤面積明顯減少(P<0.05)，這些結果提示聯合給藥可能抑制了體內腫瘤細胞生長(圖5a～b)。此外，我們還進行了組織病理學評估，對腦組織進行HE染色，結果表明對照組和單獨給藥組腫瘤細胞無明顯的形態學變化，而聯合給藥組腫瘤內的壞死細胞較多(圖5c)。同時，我們還對裸鼠原位瘤模型進行了生存時間分析，結果顯示聯合給藥組的生存時間與其他組相比明顯延長(圖5d)。以上實驗結果均表明聯合給藥通過抑制腫瘤生長進而改善模型小鼠的生存狀況，延長裸鼠的生存時間。

圖5 聯合給藥抑制裸鼠顱內腫瘤生長

2.2.2 聯合給藥誘導了裸鼠顱內腫瘤的凋亡并抑制增殖活性：為了驗證聯合給藥是否誘導了裸鼠顱內腫瘤的凋亡并抑制增殖活性，我們對各實驗組進行TUNEL檢測，結果顯示正常組和單獨給藥組凋亡細胞數量無顯著差異(P>0.05)，而聯合給藥組與其他組相比凋亡細胞數量明顯增多(P<0.05)，這表明聯合給藥誘導了裸鼠顱內腫瘤的凋亡(圖6a～b)。此外，對腫瘤組織進行免疫組織化學染色來評估反映增殖活性的Ki67蛋白表達，結果表明正常組和單獨給藥組Ki67陽性細胞數量無明顯差異(P>0.05)，細胞增殖活性強；聯合給藥組與其他組相比Ki67的表達顯著下調(P<0.05)，提示腫瘤細胞增殖活性減弱(圖6c～d)。通過以上實驗證明了聯合給藥不僅誘導了裸鼠顱內腫瘤的凋亡并且還抑制腫瘤細胞的增殖活性。

圖6 聯合給藥誘導顱內腫瘤凋亡

2.2.3 白藜蘆醇可體內激活CRABP2通路增強維甲酸敏感性：由于體外細胞實驗結果已證明Res可激活RA代謝通路增強RA的敏感性，而在體內是否與體外結果一致，為此我們選取對照組、單獨給藥組和聯合給藥組中的裸鼠顱內腫瘤組織，提取蛋白進行Western Blot和RT-qPCR實驗，檢測裸鼠顱內腫瘤細胞CRABP2及RAR/RXR的蛋白表達及mRNA水平。實驗結果表明相對于對照組和單獨給藥組，聯合給藥組中的裸鼠顱內腫瘤細胞的CRABP2及RAR/RXR的表達均出現增強(P<0.05)，與體外結果一致，提示Res增強了腫瘤細胞對RA的敏感性(圖7)。由此可以說明Res可在體內激活RA代謝通路進而增強RA的敏感性。

3 討論

Res已被研究證實具有抗腫瘤的作用，是近年來的研究熱點[7-8]。目前研究表明Res通過多種途徑發揮抗腫瘤的作用：抑制細胞色素酶、誘導解毒酶、抑制環氧合酶、抑制蛋白激酶、誘導腫瘤細胞分化、促細胞凋亡等，并且Res的抗腫瘤機制十分復雜，可能是幾種途徑聯合發揮抗腫瘤作用[10]。同時，研究發現Res針對不同的腫瘤細胞類型發揮作用的時間、濃度也有差異，即不同類型的腫瘤細胞對Res的敏感性各不相同[8,11]。有研究表明Res能夠上調CRABP2及RAR/RXR的表達，證明了Res具有通過上調CRABP2，增強腫瘤細胞對RA敏感度的潛力[12-13]。此外，由于Res具有多種生物學功能，并且已有研究證明其無毒性，在人體測試劑量范圍內對人體沒有毒害[14-15]。因此，在多種疾病的治療中Res作為治療藥物或輔助治療藥物均得到廣泛應用。

RA作為促分化劑在臨床已廣泛應用，可激活下游維甲酸反應元件，啟動凋亡通路相關基因的轉錄和表達，繼而引發腫瘤細胞的凋亡[16]。于是我們基于Res具有抗腫瘤的功能及安全性較高兩個特性，設想Res與RA聯合給藥的方式在MB的治療中是否能起到提高腫瘤細胞對RA敏感性的效果。對此，我們進行實驗研究并發現了Res對RA敏感性的調控。結果發現：Res可增加低敏感型髓母細胞瘤細胞系(UW228-3、UW228-2)對RA的敏感性。進一步探索發現，UW228-2、UW228-3經低劑量Res處理72h后，腫瘤細胞內CRABP2及其胞內受體RAR/RXR的表達出現增強。Res可能通過增加MB對RA的敏感性從而提高抗腫瘤效果，而Res通過激活RA代謝通路進而增強RA的敏感性是其可能作用的途徑。

雖然我們的研究初步證明了Res通過激活CRABP2凋亡通路進而增強RA的敏感性，促使RA誘導細胞凋亡，但Res是否作用于其他信號轉導通路，進而增強了RA的敏感性并抑制腫瘤細胞增殖，這是我們值得繼續深入探究的問題。后期對Res與RA聯合給藥對抗髓母細胞瘤的作用途徑需進一步闡明，為MB的臨床治療方案選擇以及為改善患者的生存質量提供理論依據。