黃芩、黃連和黃柏對CRKP的抑菌作用研究*

唐金蓉 李 盛 張曼俐 李鳳至

四川省綿陽市中醫醫院 621000

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae,CRKP)的檢出近年來呈現出明顯的上升趨勢，且對多種抗生素均表現出較高的耐藥性，其致死率高，預后差，為臨床治療帶來巨大壓力[1-3]。隨著對中藥抑菌研究的深入，發現中藥在抑菌方面有獨特優勢，甚至對于多重耐藥菌也可以發揮一定作用[4]。目前對中藥聯合抗生素對多重耐藥菌的抑菌作用研究較多，但中藥之間的聯合作用研究較少。本研究特選用黃芩、黃連和黃柏這三種中藥進行研究，觀察單味中藥和聯合用藥對CRKP的體外藥敏作用，為中藥抗多重耐藥菌提供更多的思路。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選取我院檢驗科微生物室日常培養標本中篩出的致病菌，標本類型為痰液、血液等。共收集8株細菌，要求鑒定結果為肺炎克雷伯菌，藥敏結果為亞胺培南耐藥，并且用紙片法對亞胺培南的藥敏結果進行復核，兩種方法亞胺培南均為耐藥的菌株予以納入。將菌株分純后放入含肉湯的無菌密封容器中，置于-70℃冰箱保存。

1.2 藥物來源 黃芩(批號：21100148)、黃連(批號：20190055)、黃柏(批號：20190042)三種中藥顆粒均來自四川新綠色藥業科技發展有限公司。

1.3 儀器與試劑 鑒定用梅里埃全自動鑒定儀VITEK2 Compact。所有鑒定試劑來自法國梅里埃，鑒定和藥敏用GN卡、GN13卡。亞胺培南藥敏紙片來自Oxoid Limited。質控菌株來自溫州康泰，主要為霍氏腸桿菌ATCC700203、嗜麥芽窄食假單胞菌ATCC17666等。MH肉湯干粉來自杭州濱和。血平板等來自鄭州安圖生物。96孔U型培養板來自優耐特。

1.4 方法

1.4.1 藥液的制備：以黃芩為例，將5g黃芩顆粒加入5ml無菌蒸餾水中，用渦輪混勻器充分混勻溶解，必要時在水浴箱中孵育使其充分溶解，再用濾紙過濾。配制成1 000mg/ml的黃芩藥液置于4℃冰箱中備用。

1.4.2 菌液制備：將菌株從冰箱取出解凍后接種于血平板，35℃孵育16～24h后，取單個菌落轉種血平板孵育16～24h備用。挑取單個菌落至專用細菌稀釋液中，用比濁儀將菌液濃度調至0.5麥氏單位(細菌濃度為1×108CFU/ml)，然后稀釋100倍，即得到細菌濃度為1×106CFU/ml菌液備用。

1.4.3 測定黃芩、黃柏和黃連分別對CRKP的最低抑菌濃度(MIC)：采用微量肉湯稀釋法，用96孔細胞培養板進行反應。(2)以黃芩為例，第1孔為陽性對照，加入100μl 經高壓滅菌的MH肉湯和100μl菌液，第2孔為陰性對照100μl MH肉湯和100μl藥液，第3孔加入200μl起始濃度為1 000μg/ml的黃芩藥液，第4～12孔分別加入100μl MH肉湯，將第3孔的藥液加100μl到第4孔，混勻后再吸取100μl到第5孔以此類推進行倍比稀釋，使黃芩藥液調節為2～1 000mg/ml的10個濃度梯度。(3)第3～12孔分別加入100μl之前準備好的菌液，每孔細菌的終末濃度為5×105CFU/ml。(4)35℃孵育16～24h后觀察菌液生長情況，以小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。(5)由于黃連等藥物顏色較深，或是藥物沉積不利于觀察，則可將該孔中的液體轉種至平板35℃孵育16～24h再觀察是否有細菌生長。

1.4.4 測定黃芩、黃柏和黃連兩兩聯合對CRKP的聯合藥敏：(1) 采用微量肉湯稀釋棋盤法進行藥敏實驗: 以黃芩和黃連為例，將黃芩和黃連分別從2倍MIC值開始用MH肉湯稀釋8個稀釋倍數備用，96孔板的行和列分別按濃度從大到小加黃芩和黃連藥液，每孔50μl，再每孔加入100μl菌液。(2) 每行的最后兩孔分別作為陰性對照和陽性對照加樣。(3)35℃孵育16～24h后讀取結果，無細菌生長的最低藥物濃度為MIC。(4)部分抑菌濃度指數(Fractional inhibitory concentration index,FIC )計算方法：FIC=MIC甲藥(單測)/MIC甲藥(聯合)+MIC乙藥(單測)/MIC乙藥(聯合)。FIC結果解讀：FIC≤0.5,則表示兩種藥物之間具有協同作用。FIC>0.5～1，則表示兩種藥物之間具有相加作用。FIC>1～2，表示無關作用。FIC>2，表示存在拮抗作用。

1.5 統計學方法 應用SPSS21.0統計軟件進行數據分析。計數資料以[n(%)]表示，比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩、黃柏和黃連分別對8株CRKP的MIC值 黃芩對CRKP的MIC為250～1 000mg/ml，黃連對CRKP的MIC為250～1 000mg/ml，黃柏對CRKP的MIC均為>1 000mg/ml。詳見表1。

2.2 黃芩、黃柏和黃連兩兩組合對8株CRKP的MIC和FIC

表1 黃芩、黃連和黃柏對8株CRKP的MIC(mg/ml)

黃芩聯合黃連對CRKP的FIC為0.25～1.00，表現為協同作用和相加作用；黃芩聯合黃柏對CRKP的FIC為0.63～1.50，表現為相加作用和無關作用，黃連聯合黃柏對CRKP的FIC為0.53～1.50，表現為相加作用和無關作用。詳見表2。

表2 黃芩、黃連和黃柏兩兩聯合對8株CRKP的MIC和FIC

2.3 黃芩、黃連和黃柏兩兩聯合后的作用統計 黃芩聯合黃連表現為協同作用(50.0%)和相加作用(50.0%)，黃芩聯合黃柏表現為相加作用(12.5%)和無關作用(87.5%)，黃連聯合黃柏表現為相加作用(25.0%)和無關作用(75.0%)，三種組合方式的作用有差異(P=0.01<0.05),詳見表3。

表3 黃芩、黃連和黃柏兩兩聯合的作用[n(%)]

3 討論

目前對于CRKP所致感染形式嚴峻，治療主要采用以碳青霉烯類抗生素為基礎的聯合用藥，但其費用高昂，毒副作用大，且藥物的可獲得性及療效均不樂觀[5]。中藥在多重耐藥菌的防治中也有獨特的作用，篩選出有效的中藥對CRKP的防治也將發揮重要的作用。 本研究發現黃芩、黃連和黃柏三種中藥中黃芩、黃連對CRKP的效果最好，其MIC范圍均為250～1 000mg/ml，黃柏未表現出抑菌作用，對CRKP的MIC均為>1 000mg/ml。 與賴韶欽等[6]、蘭小琴等[7]的研究結果部分一致。黃芩的主要成分黃芩苷和黃芩素以及黃連的主要成分小檗堿和黃連堿均具有良好的抑菌作用[8]，所以這兩味中藥對CRKP也具有較好的抑制作用。雖然黃芩和黃連效果最好，但其MIC的濃度很高，這樣高的濃度在體內難以達到，所以單藥抗CRKP的效果很難實現。

中藥聯合方面，黃芩同黃連聯合效果最明顯，具有協同作用(50.0%)和相加作用(50.0%)。黃芩同黃柏以及黃連同黃柏聯用主要表現為無關作用。所有的聯合藥敏未發現拮抗作用。這與程招敏等[9]的研究結果完全不同，可能是由于二者選用的菌株不一樣，本試驗選用的是CRKP,而前者全部是泛耐藥菌株。本結論說明在對CRKP的治療中，具有黃芩和黃連的方劑可能會具有一定的作用。

綜上所述，黃芩、黃連和黃柏三種中藥中，黃芩、黃連對CRKP的效果最好，且二者聯用對CRKP具有協同或相加作用。本研究的不足之處在于采用的是中藥顆粒，其成分很多，可進一步研究中藥提取物的藥敏實驗，發現起抑菌作用的主要成分。目前對于中藥抑菌的研究，更多地局限在體外藥敏試驗中，可能會與體內實際療效有所差異。