亞高山繡球菌多糖的提取優化、結構表征和抗炎作用

羅巔輝，張澤彤

華僑大學生物工程與技術系，廈門 361021

繡球菌屬(Sparassis)物種肉質鮮嫩，是營養豐富的食用真菌。繡球菌屬有10個小種[1]，目前關于繡球菌多糖的研究主要集中在兩個種，分別是繡球菌(Sparassiscrispa)和廣葉繡球菌(Sparassislatifolia)。繡球菌中多糖含量豐富，是其主要生物活性物質，研究表明繡球菌多糖具有抗腫瘤作用[2,3]，腸道免疫調節功能[4-6]和抗氧化作用[6,7]。多糖的結構是其發揮生物活性的基礎，據報道S.crispa的主要多糖是有分支結構的β-(1→3)-D-葡聚糖，但其分子量(200 kDa)較大難溶于水[8,9]。S.latifolia中分離出的多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、和果糖構成，空間結構研究表明該多糖為網狀結構，其化學結構不明確[6]。本課題以亞高山繡球菌(S.subalpina)為原料，詳細表征其主要多糖的化學結構和空間結構，并對其抗炎活性進行研究，相較于繡球菌屬其他小種，目前國內外未見相關報道。繡球菌野生資源稀缺，更多小種的研究能夠幫助挖掘其應用潛力，以期更好地開發應用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

亞高山繡球菌，云南野生采摘，由華僑大學生物學教研室鑒定為繡球菌屬亞高山繡球菌(Sparassissubalpina)。所有試劑均為分析純，主要試劑包括：葡聚糖標準品(美國Sigma公司，T10貨號：D9260，T40貨號：31389，T70貨號：31390，T500貨號：31392)； DEAE Sepharose-CL 6B(瑞士Pharmacia公司，貨號：17-0710-01)；DMEM培養基(美國Hyclone公司，貨號：SH30022.01B)；脂多糖(美國Sigma公司，貨號：L2880)；胎牛血清(德國PAN-Biotech公司，貨號：P40-37500)；總RNA提取試劑盒(美國Promega公司，貨號：LS1040)；反轉錄試劑盒(美國Promega公司，貨號：A5001)；qPCR Master Mix試劑盒(美國Promega公司，貨號：A6001)。

主要儀器：MC 99-2自動蛋白分離層析儀(上海滬西儀器廠)；型號HP 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；7890 B高效氣相色譜儀(美國Agilent公司)；Forma 3111二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；CKX 41倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；AVANCE-500 MHz核磁共振儀(德國Bruker公司)；H-7650透射電子顯微鏡(日本Hitachi High-Technologies公司)；4800 II實時熒光定量PCR系統(瑞士Roche公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取優化方法

單因素試驗設計主要考察液料比、提取時間和提取溫度對總糖提取率的影響[10]。液料比研究按質量比20∶1、50∶1、80∶1、120∶1和150∶1分別加入相應體積的蒸餾水，80 ℃水浴鍋中水浴60 min。提取時間研究選取20、60、100、140和180 min為考察時間，液料比為50∶1，提取溫度為80 ℃。提取溫度研究選取30、50、65、80和100 ℃，液料比為50∶1，提取時間為60 min。每次實驗稱取干燥的亞高山繡球菌1 g，按照不同提取條件提取得到水溶性提取液，3 500 r/min離心10 min，取上清液進行苯酚-硫酸法檢測，3次平行試驗計算總糖提取率。

提取率=(W提取液糖含量/W樣品質量)× 100%

根據單因素試驗確定各因素試驗水平，安排響應曲面試驗。使用Design-Expert(Version 11，Stat-Ease Inc,USA)軟件，Box-Behnken Design(BBD)設計法安排3因素3水平試驗方案。以液料比(X1)，提取時間(X2)和提取溫度(X3)為變量，總糖含量作為響應值，優化亞高山繡球菌總糖提取工藝條件[11]。

1.2.2 分離純化方法

稱取干燥的繡球菌100 g，按照“1.2.1”所得最佳提取條件提取得到粗提液，將粗提液用旋轉蒸發儀濃縮40～50倍，加入4倍體積乙醇過夜，3 500 r/min離心10 min得沉淀，冷凍干燥后得粗多糖。取500 mg粗多糖配制成質量分數為2%～3%粗糖水溶液，使用Sevag法反復脫蛋白直至無固體蛋白層為止。將脫蛋白后的糖液上DEAE Sepharose-CL 6B柱(直徑4.6 cm × 高36 cm)，上樣量20 mL，流速為1 mL/min，12 min/管，使用0～1 mol/L NaCl進行洗脫，收集洗脫液，OD280下檢測洗脫液的蛋白質分布，苯酚硫酸法檢測洗脫液的糖分布。按照糖及蛋白質分布情況收集洗脫液，使用3 500截留分子量的透析袋蒸餾水透析48 h，濃縮透析液，冷凍干燥得到純化的亞高山繡球菌多糖(Sparassissubalpinapolysaccharide，SSP)，按如下公式計算得率。

得率=(W純化糖質量/W樣品質量)× 100%

1.2.3 均一性及特性研究方法

采用高效凝膠排阻色譜法(HPSEC)鑒定SSP的均一性，色譜柱為日本昭和SUGAR KS-804柱，色譜柱溫度是50 ℃，流動相為超純水(流速1 mL/min)，檢測器為示差折光檢測器。重均分子量鑒定采用HPSEC方法，根據葡聚糖標準品(T10、T40、T70、T500)和葡萄糖的保留時間，以lgMw對Kav作圖，繪制分子量標準曲線[12]。

采用苯酚-硫酸法[13]測定糖含量，紫外吸收光譜檢測蛋白質及核酸，紅外光譜法(FTIR)分析特征官能團[14]。單糖組成分析采用氣相色譜法，取20 mg干燥多糖溶解于1 mol/L硫酸中，100 ℃水解8 h，水解液中加入碳酸鋇中和至pH值中性，過濾后的濾液冷凍干燥得水解產物。將水解產物溶解于0.5 mL無水吡啶，加入2 mg甘露醇，70 ℃水浴30 min，冷卻后加入0.2 mL六甲基二硅胺烷和0.1 mL三甲基氯硅烷進行衍生化。衍生產物用氣相色譜法鑒定，色譜柱是HP-5毛細管色譜柱，柱溫為程序升溫，160 ℃升到180 ℃(20 ℃/min)，180 ℃升到220 ℃(8 ℃/min，保持2 min)，250 ℃(保持2 min)。檢測器是氫火焰檢測器，檢測器溫度為280 ℃[15]。為了研究多糖的熱穩定性質，取干燥的多糖樣品放入70 μL氧化鋁坩堝中，氮氣作為載氣，以10 K/min的升溫速度，在50～600 ℃內使用同步熱分析儀檢測。

1.2.4 化學結構和微觀結構分析方法

化學結構研究采用核磁共振，20 mg純化后的干燥多糖溶于2 mL重水，攪拌使其充分溶解后冷凍干燥，如此反復重復3次，檢測前將其溶解于1 mL重水，轉入核磁管進行NMR分析。使用 500 MHz核磁共振儀，使用標準Bruker程序，試驗包括氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR)、異核單量子相干譜(HSQC)、同核化學位移相關譜(1H-1H COSY)、全相關譜(TOCSY)和二維NOE譜(NOESY)。

使用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察多糖微觀結構。SEM制樣在金屬樁，表面鍍鉑。TEM觀察，將樣品配制成1 mg/mL溶液，加入等質量比的1 mg/mL SDS溶液，80 ℃水浴2 h后稀釋至5 μg/mL，繼續水浴2 h，滴加1滴樣品液到200目銅網碳膜上，室溫干燥，80 kV電壓下觀察。

1.2.5 抗炎試驗方法

抗炎實驗主要包括RAW 264.7細胞培養，總RNA的提取，反轉錄cDNA和實時熒光定量PCR檢測(RT-qPCR)，包含空白組，陰性對照組(添加1 μg/mL脂多糖)，陽性對照組(添加1 μg/mL脂多糖和75 μg/mL地塞米松)和樣品組(添加1 μg/mL脂多糖和不同濃度多糖SSP)。

RAW 264.7細胞的培養使用DMEM培養基(含10%血清和1%雙抗)，37 ℃，5%二氧化碳培養箱培養48 h。總RNA的提取和反轉錄cDNA均采用試劑盒方法，反轉錄程序為42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。RT-qPCR檢測采用SYBR Green染料法，按照試劑盒說明書操作，反應體系包括2 × Mix，上下游引物[16]和cDNA，共進行45個循環，擴增條件為95 ℃(15 s)→ 60 ℃(30 s)→ 72 ℃(30 s)。每個實驗包括3個平行樣，以GAPDH為內參基因，按照2-ΔΔCT法計算各炎癥因子mRNA的相對表達量[15,16]。

2 結果與分析

2.1 亞高山繡球菌總糖提取優化

2.1.1 單因素試驗結果

各單因素對亞高山繡球菌總糖提取率的影響如圖1所示。在固定兩個因素條件下，只考察一個因素對提取率的影響。隨液料比增加提取率增大，當液料比達到50∶1時提取率最大，隨后陡然下降。隨提取時間的改變，總糖提取率呈現逐漸上升趨勢，提取時間100 min時提取率最高，隨后降低，整體趨勢變化較小。隨提取溫度升高提取率逐漸增加，提取溫度達到50 ℃以上，提取率相差幅度在4%以內，變化不明顯。為保證原材料中的總糖能夠充分提取出來，不造成多糖的斷裂而降低其生物活性，同時減少操作工作量，選用液料比20∶1、50∶1、80∶1，提取時間60、100、140 min，提取溫度65、80、95 ℃作為后續優化工藝試驗條件。

圖1 液料比(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)對亞高山繡球菌總糖提取率的影響Fig.1 Effects of liquid∶solid (A),extraction time (B) and extraction temperature (C) on the yields of total sugar from S.subalpina

2.1.2 響應面試驗結果

響應面試驗采用Design-Expert軟件設計，BBD試驗設計和結果見表1。試驗所用3個因素的試驗水平根據單因素結果選取，具體如下，液料比(X1)為20∶1、50∶1和80∶1，提取時間(X2)為60、100、140 min，提取溫度(X3)為65、80、95 ℃。

用Design-Expert軟件進行分析，得到回歸方程如下：Y=14.84+2.29X1+0.14X2-0.59X3-2.54X1X2-0.10X1X3+0.80X2X3-1.52X12+0.01X22-1.08X32。模型的P值為0.001 6，相關系數R2= 0.91，校正決定系數R2(0.80)與預測R2(0.66)相差小于0.2，說明實測值與該模型預測值具有很好的擬合度，模型符合統計學意義。模型失擬項為0.86(> 0.05)，進一步說明擬合模型誤差與純誤差相比不顯著，在試驗變量范圍內，回歸模型預測結果可靠。在模型預測的最優提取條件下(X1= 80 mL/g，X2= 60 min，X3= 70 ℃)，亞高山繡球菌總糖提取率的預測值18.54%和實際試驗值(18.21 ± 0.68)%相差不顯著，該模型可以很好地用于亞高山繡球菌總糖的提取工藝。根據模型的回歸系數顯著性檢驗結果，液料比對亞高山繡球菌總糖的提取率影響最顯著(P= 0.000 7)，與單因素試驗結果吻合，因此，在實際提取工藝中應著重注意對液料比的選取。

2.2 多糖SSP的純化與特性分析

按照響應面試驗得出的最佳提取工藝提取得到粗提液，對所得粗提液進行濃縮、醇沉后冷凍干燥，得到粗多糖，得率為25.60%。將粗多糖經Sevag法脫蛋白，脫蛋白后的糖液經DEAE Sepharose CL-6B柱層析純化，苯酚-硫酸法(OD490)檢測糖分布，OD280下檢測蛋白質分布，結果如圖2A。

圖2 SSP的DEAE-Sepharose CL-6B層析圖(A)和高效凝膠排阻色譜圖(B)Fig.2 DEAE-Sepharose CL-6B chromatogram (A) and HPSEC profile (B) of SSP

在50～70管之間有一個較大的糖洗脫峰，且與蛋白質洗脫峰不重疊，收集該部分洗脫液，用截留分子量3 500的透析袋透析，透析液濃縮后冷凍干燥得到SSP，得率為10.50%。SSP的均一性鑒定采用高效凝膠排阻色譜法，結果如圖2B所示，圖中只有一個對稱峰，說明SSP的均一性好。

參照葡萄糖標準曲線y=0.014x-0.006(R2=0.999)，測得SSP的糖含量為99.30%。紫外吸收光譜顯示SSP不含有核酸及蛋白質等雜質。

SSP的FTIR結果如圖3A所示，在3 424 cm-1(O-H伸縮振動峰)，2 926 cm-1(C-H特征吸收峰)，1 640 cm-1(C=O伸縮振動峰)，1 408 cm-1(C-H變角振動峰)和1 000～1 200 cm-1(C-O伸縮振動峰)均出現糖類物質的特征吸收峰，表明SSP為糖類化合物。

SSP的熱重分析曲線(TG)及一階微商曲線(DTG)如圖3B所示。在65～116 ℃之間出現第一個失重臺階，此部分失重主要是樣品吸附水的蒸發。第二個較大失重臺階出現在258～408 ℃范圍內，SSP在這個溫度范圍內結構發生了劇烈的分解。SSP的熱重分析只出現1個大的失重，也進一步驗證了SSP物質成分單一，純度較好。

根據標準葡聚糖的HPSEC保留時間，計算得到回歸方程為y=-3.92x+6.31(R2= 0.990，圖2B)，將SSP在HPSEC試驗中的保留時間7.47 min代入方程，計算得出SSP的重均分子質量(Mw)為50 kDa。

圖3 SSP的紅外光譜圖(A)、熱重分析圖(B)和氣相色譜圖(C)Fig.3 FTIR spectrum (A),thermal decomposition analysis curves (B) and GC profiles of SSP (C)注：*內標甘露醇；1～4分別代表葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖的衍生物。Note:*Mannitol;1-4 refer to derivatives of glucose,galactose,mannose and arabinose.

將完全水解后的多糖SSP衍生化，衍生產物用GC法檢測，結果如圖3C所示。對照標準單糖衍生化后的GC圖3C，可以得出SSP由葡萄糖，甘露糖，半乳糖和阿拉伯糖組成，各單糖摩爾質量比為6.5∶1.3∶1∶1。

2.3 SSP的結構表征

SSP的1 D和2 D NMR結果如圖4所示。根據1H NMR、13C NMR和HSQC，檢測出4個異頭質子，化學位移是δ4.58(1H，d，J= 7.9 Hz)、4.86(1H，s)、4.99(1H，s)和5.24 ppm(1H，s)，對應13C NMR的化學位移分別是103.10、102.01、103.10和101.73 ppm。按照異頭質子化學位移從高場到低場，依次將其命名為糖殘基A～D，各糖殘基的摩爾比為6∶1.2∶1∶1，與單糖組成結果相吻合。從異頭質子出發，通過COSY和TOCSY譜得到糖殘基中氫的化學位移，根據氫的化學位移通過HSQC譜得出相對應的13C NMR化學位移，糖殘基A～D的1H NMR和13C NMR化學位移如表2所示。

圖4 SSP的1H NMR(A)、13C NMR(B)、HSQC(C)、COSY(D)、TOCSY(E)和NOESY譜(F) Fig.4 1H NMR (A),13C NMR (B),HSQC (C),COSY (D),TOCSY (E) and NOESY (F) spectra of SSP

表2 SSP的1H NMR和13C NMR數據

SSP的單糖組成分析顯示葡萄糖占比最多，NMR顯示糖殘基A摩爾比例最高，且H2化學位移在高場區，說明A是葡萄糖構型。糖殘基A的H1在4.4～4.8 ppm之間，且JH1,H2(7.9 Hz)在6～8之間，說明糖殘基A為β構型。糖殘基C的異頭氫小于5.4 ppm，JH1,H2< 2 Hz，C4在82～84 ppm，說明糖殘基C是呋喃阿拉伯糖，異頭碳在103 ppm，進一步說明其為β構型。糖殘基D 在COSY譜中只有H1～H3的化學位移，其他質子化學位移由TOCSY譜獲得，其異頭質子化學位移(5.4 ppm)大于5.0 ppm，JH1,H2< 3 Hz，說明糖殘基D是α-半乳糖構型。根據糖殘基B的13 C化學位移，其為甘露糖，由于JH1,H2很小，無法判斷構型，但其NOESY譜中H1和H2有交叉峰，說明為α構型。根據表2中13C NMR化學位移，對照標準化學位移表，13C NMR化學位移向低場區有較大遷移，則該位置發生取代。糖殘基A～D分別是→2)-β-D-Glup-(1→，→3)-α-D-Manp-(1→，→3)-β-L-Araf-(1→ 和 →3)-α-D-Galp-(1→。

NOESY譜中觀察到糖殘基D的H1與糖殘基A的H2有NOE效應，說明糖殘基D與糖殘基A相連接，即→3)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Glup-(1→。糖殘基C的H1與糖殘基B的H3有NOE效應，說明糖殘基C與糖殘基B相連接，即→3)-β-L-Araf-(1→3)-α-D-Manp-(1→。綜上所述，SSP的重復結構單位是→3)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Glup-(1→3)-β-L-Araf-(1→3)-α-D-Manp-(1→。

采用SEM和TEM觀察SSP的微觀結構，結果見圖5。SEM 顯示SSP是片狀結構，表面無孔，說明沒有分支結構。高放大倍數SEM下可見SSP表面粗糙，說明糖鏈之間互相交疊或纏繞，且凸起呈網狀交織樣。TEM 顯示SSP無分支，為多個糖鏈相互交織在一起的網狀結構，與上述NMR和SEM分析的結構吻合。

圖5 SSP的掃描電鏡圖(A～C，500～10 000×)和透射電鏡圖(D,5 000×)Fig.5 SEM (A-C,500-10 000×) and TEM images (D,5 000×) of SSP

2.4 SSP的抗炎癥作用

為了選擇安全無毒的SSP添加量，首先對SSP進行細胞毒研究，試驗結果如圖6A。顯著性分析結果表明，添加25或75 μg/mL的SSP對RAW 264.7細胞增長沒有細胞毒性，因此選擇這兩個濃度進行抗炎癥試驗。對各組細胞提取總RNA，反轉錄得到cDNA，采用相應的引物進行RT-qPCR。RT-qPCR結果顯示擴增曲線均呈現S型，說明所得CT值可信度高，熔解曲線均呈現單一對稱峰，進一步說明引物特異性高，獲得目標擴增基因。根據所得CT值，采用2-ΔΔCT法計算各mRNA相對內參基因GAPDH的表達量，結果如圖6所示。為了誘導RAW 264.7細胞產生炎癥模型，陰性組添加了LPS，相較于空白組，陰性組TNF-α、COX-2和iNOS的mRNA表達量都極顯著增加(P<0.001)，說明炎癥模型構建成功。

圖6 SSP對RAW 264.7的細胞毒作用(A)以及對TNF-α(B)、COX-2(C)和iNOS(D)mRNA表達的影響Fig.6 Cytotoxicity of SSP on RAW 264.7 cells (A),and effects on TNF-α (B),COX-2 (C) and iNOS (D) mRNA expression注：與空白組比較，#P < 0.05；不同小寫字母表示差異顯著，P < 0.05。Note:Compared with control,#P < 0.05;Different lowercase letter refer to significant differences(P < 0.05).

RAW 264.7細胞中添加LPS后，添加地塞米松作為陽性對照組，不同濃度SSP作為兩個樣品組。從圖6可以看出，與陰性組相比，陽性對照組和兩個樣品組的TNF-α、COX-2和iNOS表達量均顯著降低(P<0.05)，說明均具有抗炎癥作用。兩個不同濃度樣品組對TNF-α、COX-2和iNOS基因表達影響差異不顯著(P>0.05)，說明SSP的抗炎癥作用并不呈現劑量效應。在25或75 μg/mL不同質量濃度下，SSP對TNF-α表達的抑制率分別是69.0%和78.2%，對COX-2表達抑制率分別是41.4%和43.5%，對iNOS基因表達抑制率分別是43.5%和47.7%。顯著性分析結果顯示，SSP對TNF-α和iNOS表達抑制作用與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，說明SSP的部分抗炎癥作用與地塞米松相當。

3 結論

獲得亞高山繡球菌總糖提取工藝模型Y=14.84+2.29X1+0.14X2-0.59X3-2.54X1X2-0.10X1X3+0.80X2X3-1.52X12+0.01X22-1.08X32，得到最佳提取條件(液料比=80 mL/g，提取時間=60 min，提取溫度=70 ℃)，該條件下提取率為(18.21 ± 0.68)%。從亞高山繡球菌中分離純化得到1個水溶性多糖SSP，得率為10.50%。SSP組分均一，含有糖類物質的特征官能團，糖含量為99.30%，不含有蛋白質和核酸，在258～408 ℃范圍內發生物質分解，重均分子質量是50 kDa，由葡萄糖，甘露糖，半乳糖和阿拉伯糖組成，各單糖摩爾質量比為6.5∶1.3∶1∶1。SSP是無分支結構的多糖，其化學結構的重復單位是→3)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Glup-(1→3)-β-L-Araf-(1→3)-α-D-Manp-(1→，空間結構表現為多糖鏈交織的網狀結構。成功建立炎癥模型，25或75 μg/mL多糖SSP對炎癥細胞RAW 264.7中TNF-α、COX-2和iNOS的表達均有顯著抑制作用(P<0.05)，且SSP對TNF-α和iNOS表達抑制作用與陽性對照組無差異(P>0.05)。

據報道，腦出血病人和阿爾茨海默病(AD)患者體內趨化因子(TNF-α)含量明顯增多[17]，TNF-α能增加斑塊沉積，具有神經毒性，會進一步激活iNOS基因過表達，從而造成神經元細胞損傷和凋亡[18]。亞高山繡球菌多糖能有效抑制TNF-α和iNOS的過量表達，作為結構明確的天然食用菌，對中樞系統疾病具有良好的保健作用。