陰地翠雀花的化學成分研究

郭秋菊，楊傳輪，陳 琳，黃 帥，郭春生，張純姑*

1西南交通大學生命科學與工程學院；2西南交通大學物理科學與技術學院，成都 610031；3黃河三角洲京博化工研究院有限公司，濱州 256500

翠雀屬(Delphinium)為毛茛科(Ranuculaceae)多年生或一、二年生草本植物，在全球約有300種，廣泛分布于北半球地區，我國有近220種[1]。在我國，翠雀屬多種植物具有悠久的藥用歷史，可治療跌打損傷、風濕、牙痛和腸炎等疾病[2]。二萜生物堿是一類結構復雜的天然產物，廣泛存在于翠雀屬植物中，基本骨架主要分為C18-、C19-和C20-二萜生物堿[3]；現代藥理研究表明二萜生物堿具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤和抗心律失常等藥理活性[4]。有研究證明烏頭堿型C19-二萜生物堿forrestline F，以及阿替生型C20-二萜生物堿songorine具有一定的抗炎活性[5,6]；牛扁堿型C19-二萜生物堿delbrunine和delpheline，以及阿替生型C20-二萜生物堿delphatisine C具有一定的抗腫瘤活性[7]。陰地翠雀花(DelphiniumumbrosumHand.-Mazz.)為毛茛科翠雀屬植物，產于云南西北部(中甸至德欽一帶)，生長在海拔3 500～3 900 m間山地草坡或林下[8]。目前，未見陰地翠雀花的化學成分及生物活性研究報道。因此，為了補充陰地翠雀花的研究空白，為其開發利用提供理論指導。本文對陰地翠雀花的生物堿成分進行系統研究，并測試了部分化合物對脂多糖誘導小鼠RAW 264.7巨噬細胞產生NO的抑制作用，以及所有化合物對小鼠乳腺癌4T1細胞的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

核磁共振波譜儀(Bruker AV 400和600，TMS為內標，CDCl3為溶劑)；超高效液相色譜(ACQUITY UPLCI-Class)與四級桿飛行時間質譜(Xevo G2-S QTof)聯用儀(Waters 公司)；RE-2000A 旋轉蒸發儀(上海亞榮)；ZF-20C 紫外光譜儀、電子分析天平(托利多上海儀器有限公司)。薄層層析硅膠 GF254(青島海洋化工廠)；柱層析硅膠G和H(200～400目，青島海洋化工廠)；顯色劑為改良碘化鉍鉀溶液和碘蒸氣；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、二乙胺等試劑均為分析純。

全自動酶標儀(Molecular儀器公司)；CO2培養箱(Panasonic公司)；旋渦混合器(金怡儀器科技有限公司)；脫色搖床儀(百島生物公司)；顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)。培養基、胎牛血清和脂多糖(Natocor公司)；RAW 264.67細胞(ATCC 細胞庫)；NO檢測試劑盒(碧云天生物公司)。

1.1.2 實驗藥材

所使用的陰地翠雀花樣品于2020年8月采自云南省迪慶州香格里拉市虎跳峽鎮，經云南中醫學院李國棟副教授鑒定為陰地翠雀花(DelphiniumumbrosumHand.-Mazz.)，標本(2020HS00002)留存于西南交通大學生命科學與工程學院。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

將干燥的陰地翠雀花全草部分(10.0 kg)，粉碎后用95%乙醇浸提5天(4次)，回收濾液、減壓濃縮得總浸膏1.2 kg，用溫水溶解浸膏后，加入稀釋的鹽酸水溶液，調節pH至2～3，用石油醚(4.0 L)萃取4次，萃取液進行減壓濃縮。隨后水層用氨水調節pH至9～10，二氯甲烷萃取至無生物堿，減壓濃縮萃取液，得總生物堿73.0 g。

陰地翠雀花的總生物堿經正相硅膠柱層析初步分離，選用洗脫劑(二氯甲烷∶甲醇100∶1→0∶1)進行梯度洗脫，得到A～D四個部分。B部分通過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺50∶1∶0.03→0∶1∶0.03)洗脫得到B1和B2兩個部分。B1部分通過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯30∶1→0∶1)梯度洗脫，得到B1-1、B1-2和B1-3三個部分；B1-2部分通過硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺15∶1→4∶1)梯度洗脫，得到化合物14(120.0 mg)；B1-3部分通過硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇80∶1→10∶1)梯度洗脫，得到化合物4(13.0 mg)，化合物5(19.0 mg)，化合物11(230.0 mg)和化合物12(50.0 mg)。B2部分通過硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺20∶1→0∶1)梯度洗脫，得到化合物6(16.0 mg)。C部分通過硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇60∶1→0∶1)洗脫得到C1、C2、C3和C4四個部分。C1部分經硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺15∶1→3∶1)洗脫得到化合物10(180.0 mg)；C2部分通過硅膠柱層析(乙酸乙酯∶二乙胺50∶1→8∶1)梯度洗脫得到化合物2(140.0 mg)和化合物9(50.0 mg)；C3部分經硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺30∶1∶0.1→0∶1∶0.1)洗脫得到化合物1(113.0 mg)；C4部分通過硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇40∶1→5∶1)梯度洗脫得到化合物3(6.0 mg)。D部分通過硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇70∶1→0∶1)洗脫得到D1、D2和D3三個部分。D2部分通過硅膠柱層析(乙酸乙酯∶二乙胺40∶1→5∶1)洗脫得到化合物7(22.0 mg)和化合物13(6.0 mg)；D3部分通過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺30∶1∶1→5∶1∶1)洗脫得到化合物8(287.0 mg)。

1.2.2 體外抗炎活性測試

采用MTT法測定所有化合物對小鼠單核巨噬RAW 264.7細胞的存活率[9]。將RAW 264.7細胞以100 μL/孔(每孔含6×103個細胞)接種至96板孔中培養12 h。加入含藥培養基(40 μmol/L，100 μL/孔)，正常組和空白組加入含1% DMSO的培養基(100 μL/孔)培養24 h后，加入5 mg/mL MTT(20 μL/孔)培養4 h，棄去上清液，加入DMSO(150 μL/孔)，搖床震蕩10 min后，采用酶標儀在492 nm處讀取吸光值(A)。

細胞存活率=

[(A樣品-A空白)/(A正常對照-A空白)]×100%

采用Griess法考察部分化合物的抗炎活性，測定其對由脂多糖誘導的小鼠單核巨噬RAW 264.7細胞炎癥的抗炎作用[10,11]，以塞來昔布(10 μmol/L)為陽性對照。將RAW 264.7細胞以100 μL/孔(每孔含2×104個細胞)在96板孔中培養12 h，用LPS(1 μg/mL)和含藥培養基(40 μmol/L，100 μL/孔)預處理24 h，模型組與空白組加入培養基。按NO試劑盒說明書進行操作，并用酶免疫測定儀在540 nm處測量吸光值(A)。

NO生成抑制率=

[(A模型-A樣品)/(A模型-A空白)]×100%

1.2.3 體外抗腫瘤活性測試

采用MTT法測定化合物對小鼠乳腺癌4T1細胞的生長抑制率[12,13]，以紫杉醇(10 μmol/L)為陽性對照。將4T1細胞以100 μL/孔(每孔含2×104個細胞)在96板孔中培養12 h，加入含藥培養基(40 μmol/L，100 μL/孔)，正常組和空白組加入含1% DMSO的培養基(100 μL/孔)培養24 h，于96板孔中重新加入5 mg/mL MTT(20 μL/孔)和培養基培養4 h，棄去上清液，加入DMSO(150 μL/孔)，搖床震蕩10 min后，采用酶標儀在492 nm處讀取吸光值(A)。

細胞生長抑制率=

[(A正常對照-A樣品)/(A正常對照-A空白)]×100%

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

圖1 化合物1～14的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-14

化合物8白色無定形粉末，碘化鉍鉀溶液呈陽性反應；HR-ESI-MS：m/z700.381 8 [M+H]+(calcd for C37H54N3O10，700.380 9)，分子式C37H53N3O10。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.05/11.15(1H，br s，NH)，7.09～8.68(4H，m，Ar-H)，3.59(1H，t，J=4.8Hz，Hβ-14)，3.38，3.36，3.32，3.24(各3H，s，4×OMe)，1.04(3H，t，J=7.2Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：84.0(d，C-1)，26.1(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.6(s，C-4)，43.3(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.6(s，C-7)，77.6(s，C-8)，50.5(d，C-9)，38.1(d，C-10)，49.1(s，C-11)，28.7(t，C-12)，46.1(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.7(t，C-15)，82.6(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.9(t，C-18)，52.4(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.2/14.3(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.2(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.0(s，OCOAr)，115.0(s，C-1′)，141.8(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，134.9(d，C-4′)，122.8(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，173.9/170.7(s，C-1′′)，39.5/42.0(d/t，C-2′′)，39.2/36.5(t/d，C-3′′)，174.8/178.1(s，C-4′′)，18.2/17.8(q，C-5′′)。以上數據與文獻報道[21, 22]基本一致，故鑒定化合物8為一對區域異構體，德爾色明A和B。

化合物9白色無定形粉末，碘化鉍鉀溶液呈陽性反應;HR-ESI-MS：m/z701.365 8 [M+H]+(calcd for C37H53N2O11，701.364 9)，分子式C37H52N2O11。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：10.97/11.05(1H，br s，NH)，7.06～8.73(4H，m，Ar-H)，3.38，3.34，3.32，3.23(各3H，s，4×OCH3)，1.04(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.9(d，C-1)，26.2(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.6(s，C-4)，43.3(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.6(s，C-7)，76.6(s，C-8)，50.5(d，C-9)，38.2/37.9(d，C-10)，49.1(s，C-11)，28.7(t，C-12)，46.2(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.8(t，C-15)，82.6(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.5/69.8(t，C-18)，52.4/53.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.2(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.1(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.0/167.9(s，OCOAr)，114.6(s，C-1′)，142.0/142.3(s，C-2′)，120.5(d，C-3′)，134.9(d，C-4′)，122.4/122.3(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，171.8(s，C-1′′)，42.0/38.6(t/d，C-2′′)，37.9/41.4(d/t，C-3′′)，177.8/176.0(s，C-4′′)，18.1/18.2(q，C-5′′)。以上數據與文獻報道[21]基本一致，故鑒定化合物9為一對區域異構體，delavaine A free acid和delavaine B free acid。

化合物10白色無定形粉末，碘化鉍鉀溶液呈陽性反應;HR-ESI-MS：m/z715.378 7 [M+H]+(calcd for C38H55N2O11，715.380 6)，分子式C38H54N2O11。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.15/11.03(1H，br s，NH)，7.09～8.69(4H，m，Ar-H)，3.39，3.37，3.33，3.25(各3H，s，4×OCH3)，1.05(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：84.0(d，C-1)，26.2(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.6(s，C-4)，43.3(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.6(s，C-7)，77.6(s，C-8)，50.5(d，C-9)，38.2(d，C-10)，49.2(s，C-11)，28.8(t，C-12)，46.2(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.8(t，C-15)，82.6(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.8(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.2(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.2(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.1(s，OCOAr)，114.8/114.7(s，C-1′)，142.0/141.7(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.6(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，172.6/170.0(s，C-1′′)，41.5/39.1(t/d，C-2′′)，39.1/37.6(d/t，C-3′′)，174.2/176.1(s，C-4′′)，18.0/17.2(q，5′′)，51.8/52.1(q，C-6′′)。以上數據與文獻報道[23]基本一致，故鑒定化合物10為一對區域異構體，德拉瓦印A和B。

化合物11白色無定形粉末，碘化鉍鉀溶液呈陽性反應;HR-ESI-MS：m/z729.397 8 [M+H]+(calcd for C39H57N2O11，729.396 2)，分子式C39H56N2O11。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.14/11.02(1H，br s，NH)，7.08～8.70(4H，m，Ar-H)，3.39，3.36，3.32，3.24(各3H，s，4×OCH3)，1.05(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：82.7(d，C-1)，26.2(t，C-2)，32.3(t，C-3)，37.7(s，C-4)，43.4(d，C-5)，91.1(d，C-6)，88.6(s，C-7)，77.6(s，C-8)，50.6(d，C-9)，38.2(d，C-10)，49.2(s，C-11)，28.8(t，C-12)，46.2(d，C-13)，84.0(d，C-14)，33.8(t，C-15)，82.7(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.9/69.8(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.1(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，57.9(q，6-OCH3)，58.2(q，14-OCH3)，56.4(q，16-OCH3)，168.1(s，OCOAr)，114.8(s，C-1′)，141.8/142.0(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.6(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，172.1/170.1(s，C-1′′)，39.2/41.6(d/t，C-2′′)，38.0/36.1(t/d，C-3′′)，174.3/175.6(s，C-4′′)，18.0/17.2(q，5′′)，60.7(t，C-6′′)，14.2(q，C-7′′)。以上數據與文獻報道[24]基本一致，故鑒定化合物11為一對區域異構體，拉翠堿A和B。

化合物12白色無定形粉末，碘化鉍鉀溶液呈陽性反應;HR-ESI-MS：m/z729.359 1 [M+H]+(calcd for C38H53N2O12，729.359 9)，分子式C38H52N2O12。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：11.05(1H，br s，NH)，7.09～8.68(4H，m，Ar-H)，3.41，3.36，3.23(各3H，s，3×OCH3)，1.06(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.8(d，C-1)，25.9(t，C-2)，32.0(t，C-3)，37.7(s，C-4)，50.2(d，C-5)，90.8(d，C-6)，88.5(s，C-7)，77.3(s，C-8)，43.6(d，C-9)，45.7(d，C-10)，49.0(s，C-11)，28.2(t，C-12)，37.9(d，C-13)，74.8(d，C-14)，33.1(t，C-15)，83.3(d，C-16)，64.6(d，C-17)，69.8(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.1(t，C-21)，14.1(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，58.3(q，6-OCH3)，57.9(q，16-OCH3)，168.1(s，OCOAr)，114.8(s，C-1′)，141.6(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.8(d，C-5′)，130.4(d，C-6′)，170.4(s，C-1′′)，41.3(t，C-2′′)，36.0(d，C-3′′)，179.8(s，C-4′′)，17.1(q，C-5′′)。以上數據與文獻報道[25]基本一致，故確定該化合物為umbrosumine C。

化合物13白色無定形粉末，碘化鉍鉀溶液呈陽性反應;HR-ESI-MS：m/z728.375 8 [M+H]+(calcd for C38H54N3O11，728.375 8)，分子式C38H53N3O11。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：11.18/11.07(1H，br s，NH)，7.12～8.70(4H，m，Ar-H)，3.43，3.38，3.25(各3H，s，3×OCH3)，1.07(3H，t，J=7.2 Hz，N-CH2CH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：84.0(d，C-1)，26.1(t，C-2)，31.6(t，C-3)，37.8(s，C-4)，50.5(d，C-5)，91.0(d，C-6)，88.7(s，C-7)，77.4(s，C-8)，43.7(d，C-9)，45.9(d，C-10)，49.1(s，C-11)，28.2(t，C-12)，37.9(d，C-13)，74.8(d，C-14)，33.2(t，C-15)，83.4(d，C-16)，64.6(d，C-17)，70.0(t，C-18)，52.5(t，C-19)，51.2(t，C-21)，14.2(q，C-22)，55.9(q，1-OCH3)，58.3(q，6-OCH3)，57.9(q，16-OCH3)，170.9(s，14-OCOCH3)，168.1(s，OCOAr)，115.1(s，C-1′)，141.8(s，C-2′)，120.8(d，C-3′)，135.0(d，C-4′)，122.8(d，C-5′)，130.5(d，C-6′)，174.8(s，C-1′′)，42.1/39.6(t/d，C-2′′)，36.5/39.3(d/t，C-3′′)，177.8/173.7(s，C-4′′)，17.9/18.4(q，C-5′′)。以上數據與文獻報道[26]基本一致，故鑒定化合物13為一對區域異構體，umbrosumines A和B。

2.2 結構鑒定分析

經結構鑒定，確定以上化合物8、9、10、11、13均為一對區域異構二萜生物堿的混合物，二者碳譜十分相似，主要區別在于苯環側鏈的甲基連接位置不同，分別連接在C-2′′和C-3′′位，進而導致C-2′′和C-3′′位的化學位移及峰型發生了變化，兩者峰型相反。化合物8中區域異構體的比例可由氫譜11 ppm處NH的積分比例呈現，其比例為3∶1，由于甲基(C-5′′)連接位置的變化[CH3(C-2′′→C-3′′)]，導致化合物8中區域異構體的C-2′′、C-3′′的峰型截然相反，由此確定化合物8為一對區域異構二萜生物堿的混合物。同理，確定化合物9、10、11、13也均為一對區域異構二萜生物堿，其比例分別為1.7∶1、1.2∶1、1.6∶1及1.3∶1。

2.3 活性測試結果

化合物濃度在40 μmol/L時，測試了化合物(3～8、10～13)對脂多糖誘導小鼠RAW 264.7巨噬細胞產生NO的抑制作用，以及化合物(1～14)對小鼠乳腺癌4T1細胞的抗腫瘤作用，結果顯示所有測試化合物均無明顯抗炎及抗腫瘤活性。

3 結論

本研究對陰地翠雀花全草進行了生物堿成分的研究，共分離得到14個生物堿，其中包括13個牛扁堿型C19-二萜生物堿，1個異喹啉類生物堿，化合物1～14均為首次從該植物中分離得到。本研究補充了陰地翠雀花的研究空白，為其植物化學分類提供了參考依據，為后續尋找活性生物堿成分提供了物質基礎。測試了化合物對小鼠RAW 264.7巨噬細胞的抗炎作用，以及對小鼠乳腺癌4T1細胞的抗腫瘤作用，結果表明所有測試化合物均無明顯抗炎及抗腫瘤活性。