基于代謝組學技術篩選與血壓升高相關的差異性代謝物

李淑敏蔣海強齊冬梅*楊雯晴*

(1.山東中醫藥大學,中醫學院, 濟南 250355;2.山東中醫藥大學,中醫藥創新研究院,濟南 250355;3.山東中醫藥大學,實驗中心, 濟南 250355;4.山東省中醫藥基礎研究重點實驗室,濟南 250355;5.教育部中醫藥經典理論重點實驗室,濟南 250355)

高血壓是全球性危害較大的心血管疾病,也是引起心臟、腎等器官損害等的主要因素,具有較高的發病率和致死率[1],而在發展中國家對血壓的控制并不理想[2]。 近年來SHR 血清的代謝組學研究發現在高血壓病理狀態下存在多種代謝紊亂,如脂質代謝(甘油磷脂、鞘磷脂和花生四烯酸)、氨基酸(色氨酸、酪氨酸)、三羧酸循環、尿素代謝、5-羥色胺突觸傳導通路等[3-5]。

針對代謝紊亂的研究,代謝組學是近二十年來發展的系統生物學方法,旨在識別生物系統內源性代謝物在內在和外在因素影響下的變化,通過非靶向、半靶向及靶向方式揭示人體在生理病理狀態下的整體的、動態的代謝變化,是醫學藥學研究的重要研究手段[6-7]。 為進一步篩選在血壓升高過程中與血壓變化相關聯的代謝物,本研究采用非靶向代謝組學技術,將篩選出處于血壓升高階段的不同周齡SHR 大鼠與正常組大鼠的差異代謝物與血壓值進行相關性分析,從而闡明高血壓發病過程中的代謝模式和代謝標志物變化,以期為高血壓的防治提供指導。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

24 只4 周齡SPF 級雄性Wistar 京都種大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)分為3 個正常組(C1、C2、C3)和24 只4 周齡SPF 級雄性SHR 分為3 個模型組(M1、M2、M3)每組均為8 只,WKY 大鼠體重約45～60 g,SHR 體重約40～55 g,購自北京維通利華實驗動物科技有限公司[SCXK(京)2021-0006],所有大鼠喂以標準飼料,飼養在山東中醫藥大學實驗中心[SYXK(魯)2017 0022]SPF 設施中,溫度為(23±1)℃,相對濕度環境為55%±5%,標準的12 h/12 h(光/暗)循環,每籠4 只,并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。 實驗方案及過程經山東中醫藥大學實驗動物中心動物倫理委員會批準(SDUTCM20201019003)。

1.2 主要試劑與儀器

乙腈、 甲醇、 甲酸(批號:190268、172071、186935,色譜級,美國Fisher 公司);超純水(屈臣氏,屈臣氏(中國有限公司));2-氯-L-苯丙氨酸(批號:C10007806,MACKLIN,上海麥克林生化科技有限公司)。

智能無創血壓計(BP-2010A,Softron,北京,中國);高速臺式離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司;Vortex-Genie2 型渦旋震蕩器,美國SI 公司;靜電場軌道阱質譜儀(QE)和Ultimate 3000 UPLC 系統(Thermo Fisher,CA,USA);Halo-C18 色譜柱(2.1×100 mm,2.7 μm;AMT,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血壓測量

采用無創套尾法檢測大鼠安靜狀態下的血壓,打開電源,選取安靜、無人、溫暖的環境,將溫度調至38℃,敏感度設置為2,預熱5 min,控制測定時籠內溫度保持不變,將大鼠前半身用鼠網網住并置入保溫筒中,配合鼠袋包裹住,暴露尾巴在鼠袋外,將尾部穿過加壓感應裝置,加壓感應器標志的尖端與鼠尾尖端方向保持一致,將加壓感應器置于大鼠尾根處,待大鼠穩定5～10 min 后,點擊血壓測定,圖像波動平穩時記錄數據,每周同一時間測量血壓3 次取平均值。

1.3.2 血清非靶向代謝組學分析

(1)樣本準備

5 周齡時取C1、M1 組,7 周齡時取C2、M2 組,9周齡時取C3、M3 組,按照30 mg/kg 劑量的腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉后采集腹主動脈血。 將血樣置于Eppendorf 管中,室溫凝固30 min,離心(4500 r/min,4℃)15 min,得到血清樣品。 將血清樣品儲存在-80℃直至下次檢測。

血清樣品在冰上4℃解凍,加入400 μL 預冷甲醇,渦旋1 min,以2-氯-L-苯丙氨酸(60 μg/mL)作為內標,取100 μL 血清樣品。 將混合物在4℃下以15 000 r/min 的速度離心15 min。 將上清液(400 μL)置于2 mL Eppendorf 管中,用氮氣吹干,然后加入100 μL 初始流動相重新溶解。 隨后,將上清液轉移到LC-MS 小瓶中。 為確保代謝分析的數據質量,通過混合來自每個樣品的5 μL 上清液制備混合質量控制樣品(quality control,QC)。

(2)血清非靶向代謝組學分析

使用UltiMate3000 超高效液相色譜儀和四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜聯合分析。 應用Halo-C18 色譜柱進行分析,柱溫:45℃,進樣量:10 μL。流動相由溶劑A(0.05%甲酸水溶液)和溶劑B(0.05%甲酸乙腈溶液)組成。 線性梯度程序如下:0 min,2% B;3 min,40% B;9 min,98% B;18 min,98% B;18.1 min,2% B;3.0 min 的平衡。 流速為0.3 mL/min。 運行樣品前,運行6 個QC 樣品以平衡儀器,然后每運行6 個樣品后運行1 個QC 樣品。質譜條件:毛細管溫度350℃;正離子模式和負離子模式毛細管電壓:3.5 kV 和3.5 kV;鞘氣45 arb;輔助氣10 arb;質量掃描范圍:80～1200 Da;質量分辨率:70000;S-Lens RF Level 為55。

(3)血清非靶向代謝組學數據處理

LC-MS 色譜數據的整體分析通過使用CD3.1(Compound Discoverer,Thermo Fisher,CA,USA)軟件對數據進行預處理,包括峰值檢測、峰值對齊和數據清洗,從CD 中篩選出各周齡中P＜0.05 的差異性代謝物,通過SIMCA-P(13.0 版;Umetrics,Umea,瑞典)對不同周齡的正常組和模型組分別采用無監督的主成分分析(principal component analysis,PCA)及有監督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)以尋找正常組與模型組之間及不同周齡的模型組間的差異,對數據進行100 次隨機排列實驗,根據R2 和Q2 檢驗數學模型建立的準確性。 篩選投影變量重要性(Projected Variable Importance,VIP)＞1 的變量為潛在生物標記物。 通過 MS/MS、 HMDB 數據庫(http:/ /www. hmdb. ca/) 和KEGG(https:/ /www.kegg.jp/)分析鑒定內源性代謝物的鑒定和確認的代謝物。

使用MetaboAnalyst 5.0 軟件[8](http:/ /www.metaboanalyst.ca)進行通路分析。 Coefficients 是代謝表征與小分子代謝物相關聯程度,將血壓值設置為Y 變量與非靶向代謝數據相關聯, 通過Coefficients 值篩選差異代謝物與血壓變化的相關性。 原始數據經過CD 軟件數據處理后可得到具體的生物標志物,包含mass 值、保留時間、相對峰面積在內的數據矩陣,將同周齡的正常組模型組分析后與不同周齡相比較,觀察不同周齡相對峰面積的變化趨勢。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 不同周齡下大鼠血壓的變化

由表1 發現與正常組相比,模型組各周齡的收縮壓與舒張壓在五周齡時具有顯著差異性,且隨著周齡的增大模型組血壓顯著升高尤以收縮壓變化最為明顯,而正常組各周齡之間的收縮壓變化無明顯差異性。

表1 不同周齡的正常組與模型組收縮壓和舒張壓的變化(±s)Table 1 Changes of systolic and diastolic blood pressure in the normal group and the model group of different ages

表1 不同周齡的正常組與模型組收縮壓和舒張壓的變化(±s)Table 1 Changes of systolic and diastolic blood pressure in the normal group and the model group of different ages

注:與正常組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。Note. Compared with the normal group, *P＜0.05, **P＜0.01.

周齡Weeks正常組WKY收縮壓SBP (mmHg)舒張壓DBP (mmHg)收縮壓SBP (mmHg)舒張壓DBP (mmHg)模型組SHR 4 139±680±3135±676±5 154±2*88±8*140±385±6 7 160±3*95±6*154±286±3 9 174±4*107±7**156±684±5 5

2.2 血清代謝組學結果

2.2.1 代謝組學圖譜

在各周齡正、負離子模式下正常組與模型組的總離子流圖有一定的差異,以5 周齡正常組與模型組大鼠為例說明兩組之間存在不同的代謝物(圖1)。

圖1 正常組和模型組在正負離子模式下的總離子流圖Note, A, Normal group in positive ion mode. B, Normal group in negative ion mode. C, Model group in positive ion mode. D, Model group in negative ion mode.Figure 1 Total ion current diagram of normal group and model group in positive and negative ion mode

2.2.2 潛在代謝物及代謝趨勢

將質譜獲得的原始數據導入CD 軟件進行分析,以P＜0.05 為條件分別篩選出各周齡的差異性代謝物。 在將以上數據導入SIMCA-P 軟件中進行下一步分析,采用有監督的PLS-DA 進行模式識別發現在正負離子下兩組大鼠分離較好,各周齡的模型的擬合能力和預測能力指數分別為:5 周齡正離子:R2Y=0.998,Q2=0.985;負離子:R2Y=0.994,Q2=0.956,7 周齡正離子:R2Y=0.994,Q2=0.989;負離子:R2Y=0.996,Q2=0.977,9 周齡正離子:R2Y=0.993,Q2=0.948;負離子:R2Y=0.989,Q2=0.901表明模型預測能力較好,且不同周齡下100 次隨機排列實驗驗證模型成功,在此模型下進一步通過VIP＞1 篩選重要的差異性代謝物,通過比對HMDB及KEGG 數據庫找出在5、7、9 周大鼠正負離子模式下共有的10 個差異性代謝物(圖2),分別是:膽堿、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、二十二碳六烯酸( docosahexaenoicacid, DHA )、 血 栓 烷 B2(thromboxanes B2,TXB2)、尿酸、16-羥基十六烷酸、十二烷二酸、12(13)-DiHOME、膽酸、牛磺鵝去氧膽酸,詳細信息見表2。

表2 不同周齡大鼠共有的10 中差異性代謝物Table 2 10 different metabolites shared by rats of different ages

圖2 5、7 及9 周下差異性代謝物韋恩圖Figure 2 Venn diagram of differential metabolites at 5, 7 and 9 weeks

對代謝物進行動態分析(見圖3),結果顯示在5周齡時10 種代謝物在正常組與模型組大鼠均無明顯變化,7 周齡時膽堿、AA、DHA、尿酸、16-羥基十六烷酸、十二烷二酸、12(13)-DiHOME、牛磺鵝去氧膽酸相對含量與正常組相比升高(P＜0.01),TXB2在7 周齡時相對含量較5 周齡下降(P＞0.05);在9 周齡時十二烷二酸、尿酸、膽酸與7 周齡及正常組相比相對含量相比降低(P＜0.01)。 在上述10 種代謝物中膽酸、16-羥基十六烷酸、12(13)-DiHOME、牛磺鵝去氧膽酸在5、7、9 周中相對含量持續上升(P＜0.01)與正常組無明顯差異。

圖3 不同周齡大鼠體內生物標志物相對含量比較(±s)Note. Compared with the normal group, **P＜0.01.Figure 3 Comparison of the relative content of biomarkers in rats of different ages

2.3 代謝通路分析及相關性分析

代謝通路代表一組代謝物通過生物化學方式聯系在一起的生物途徑,從代謝物異常到代謝通路的變化可以深入了解在生理及病理條件下的機制,通常用來表示從非靶向代謝組學中獲得的表示病理狀態下受到干擾的常見通路,為下一步疾病中的生物學聯系的驗證提供依據[6]。 通過MetaboAnalyst 將上述代謝物輸入,篩選影響值大于0.1 的代謝通路(圖4),發現花生四烯酸通路與血壓的升高密切相關。 進一步進行與血壓相關性分析如圖5,5 周時尿酸與血壓成負相關,DHA、TXB2、十二烷二酸、膽酸、AA 與血壓呈正相關,由于5 周時10 種差異性代謝物兩組相比均無差異性;7 周時TXB2與血壓正相關,DHA、尿酸、十二烷二酸、膽酸、AA 為負相關;9 周時十二烷二酸、DHA、膽酸與血壓呈正相關,TXB2、尿酸、AA 與血壓呈負相關。

圖4 10 種差異代謝物的通路分析Figure 4 Pathway analysis of 10 different metabolites

圖5 與血壓的相關分析Note. A, 5 weeks old. B, 7 weeks old. C, 9 weeks old.Figure 5 Correlation analysis with blood pressure

3 討論

SHR 高血壓模型與人類高血壓病高度類似,是目前研究高血壓病發病機制的理想動物模型[9]。SHR 模型血壓值在大鼠出生后隨著鼠齡增大而升高,大量研究表明2～4 月為高血壓的確立期[10],在4 周時SHR 和WKY 血壓無明顯差異,在6 周時高血壓的病理狀態仍不穩定,在9～11 周時血壓值逐漸達到穩定狀態[11-12],根據我們的實驗數據分析發現在第9 周時血壓已經是較穩定的高血壓狀態。 綜合以上我們選取了高血壓確立期內的5、7、9 周為研究對象,在高血壓前期階段分析血壓升高過程中的代謝紊亂,有利于準確發現與血壓升高相關的生物標志物。 高血壓的發生發展與早期的代謝紊亂密切相關,代謝紊亂進一步引起代謝綜合癥的發生,最終導致高血壓、高尿酸血癥、動脈粥樣硬化等疾病及心臟、腎臟等靶器官損傷的發生,因此我們選用早期SHR 大鼠,探究高血壓早期的代謝紊亂,以期在早期恢復正常代謝,從而達到降低血壓延緩靶器官損害的目的[13-14]。 本研究運用代謝組學對不同周齡大鼠體內小分子代謝物持續觀察,篩選出在血壓升高過程中共有的10 種代謝物,進一步與血壓進行相關性分析,結果表明花生四烯酸代謝通路與血壓的升高密切相關,同時發現脂質類代謝物密切影響血壓的變化,如AA、TXB2、DHA。

在正常組和模型組大鼠中有差異性變化的代謝物中包括多種脂類化合物,如TXB2、DHA、AA 等,脂質代謝物的異常與血管炎癥、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生發展密切相關[15]。 DHA 是一種長鏈、高度不飽和的omega-3(n-3)脂肪酸,存儲在脂肪組織中以轉化為甘油三酯釋放到血液中[16],omega-3 脂肪酸通過激活內皮型一氧化氮合酶,增加一氧化氮的可用性改善內皮功能,此過程只發生在心血管疾病人群中[17],在本研究中發現5 周時無顯著性差異,在7、9 周時模型組的DHA 相對峰面積高于正常組,盡管在9 周低于7 周,通過相關性分析發現,7 周時DHA 與血壓呈負相關,9 周時雖然呈正相關,但7 周時候相關系數絕對值遠大于9 周時相關系數的絕對值,說明DHA 的升高不能引起血壓的升高,符合上述結論,并由此推測DHA 在血壓升高中仍發揮抑制作用。

AA 也屬于一種omega-6 多不飽和脂肪酸,廣泛存在于各種組織結構中[18],在磷脂酶A2的作用下從細胞膜磷脂中釋放出游離的花生四烯酸[19]。 AA也是多種常見脂質代謝產物的前體,在環氧合酶(cyclooxygenase,COX)、脂氧合酶和細胞色素P450途徑下產生多種生物活性的代謝衍生物,如前列腺素(prostaglandins,PGs) 及血栓素(thromboxane,TXs)、白三烯及環氧二十二烷基類化合物。 其中前列腺素類代謝物,如PGD2、PGF2α等,具有改變血管張力、促進血小板的聚集作用,與高血壓、動脈粥樣硬化及糖尿病等心血管疾病密切相關[20]。 在本研究中發現5 周齡時正常組與模型組AA 相對豐度值無差異性,在7、9 周時模型組的AA 相對豐度值迅速增加且與血壓呈負相關,可能與AA 釋放具有血壓調節作用的代謝物相關。

在高血壓狀態下,COX 的表達增加促進了AA向前列腺素類代謝物的轉化,促進前列腺素類及血栓烷類代謝物的釋放,其中血栓烷類代謝物發揮重要的血壓調節作用,TXA2、TXB2作為前列腺素類物質是一種有效的血管收縮物質,它在高血壓動物的內皮細胞中合成增加,TXA2半衰期較短,半小時內可代謝成更穩定無活性的TXB2,引起血管收縮升高血壓[20]。 在本研究中TXB2在5、7 周時無差異性且與血壓的升高呈正相關,在9 周時相對豐度高于正常組,且在9 周時與血壓的升高呈負相關,通過研究表明補充DHA 能夠減少大鼠前列腺素和活性氧的釋放,增加一氧化氮的產生和抗氧化能力,改善脂質代謝,且激活鉀離子并恢復血管超極化機制參與血管擴張反應,在一定程度上減少SHR 大鼠中TXA2、PGI2和PGE2釋放的增加,改善血管內皮功能障礙[21],因此發生這種變化的原因根據以上研究猜測7 周時TXB2的下降可能與同時期DHA 的升高有關。

眾多研究表明尿酸與高血壓密切相關,尿酸主要通過引起對腎的損害引起的血壓升高,包括腎臟中腎素-血管緊張素系統的激活和尿腔內尿酸鹽晶體沉積,尿酸鹽在血管中的沉積能進一步引發促炎因子的轉錄,從而更直接的導致血管內皮功能障礙,促進了心血管疾病的發生[22]。 另外尿酸在缺氧條件下通過降低內皮型一氧化氮合酶磷酸化而損傷血管內皮功能[23]。 有研究表明尿酸可以上調內皮中的醛糖還原酶的表達[24],醛糖還原酶的表達上調可以阻斷一氧化氮和內源性果糖的產生,這一機制是高血壓狀態下血壓升高的重要發病機制[25]。本研究中在5 周時正常組與模型組無差異性,7 周時正常組高于模型組同時相關分析為負相關,9 周時模型組尿酸相對豐度值高于正常組,且與血壓升高具有正相關性,證明尿酸含量的增多與血壓的升高相關,符合上述結果。

本研究在高血壓自然發展狀態下將外在血壓表征與大鼠體內小分子代謝物相關聯,發現花生四烯酸通路代謝異常是引起高血壓發生發展的主要通路,由于DHA、TXB2等脂質類代謝物及尿酸等的異常對血壓的變化起到主要的調控作用,因此可以依據這一結果指導我們從改善生活飲食方式來減少胰島素抵抗、尿酸水平等方面精準的發揮對血壓的調節作用。 然而,本實驗中與血壓升高相關代謝物對高血壓發生發展具體的促進或抑制作用仍需通過設計全面的實驗加以闡明,并以公認的降壓藥作為對照藥物進一步明確上述代謝物對高血壓發生發展的具體作用,為闡明高血壓的發生發展機制做出新的探索,以期為延緩高血壓的發生發展提供可靠的實驗依據。