咪喹莫特致不同免疫狀態(tài)小鼠銀屑病模型比較研究

趙 亞吳亞運劉麗娟趙瑞芝*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣州 510006;2.省部共建中醫(yī)濕證重點實驗室,廣州 510006;3.廣東省中醫(yī)癥候研究重點實驗室,廣州 510006)

銀屑病是一種常見的慢性、炎癥性表皮增殖性、無傳染性的紅斑鱗屑性皮膚病,其發(fā)病率高,是目前國內(nèi)外皮膚科領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點[1]。 然而,銀屑病發(fā)病機(jī)制不清,導(dǎo)致銀屑病的治療目前主要還是對癥治療,復(fù)發(fā)率極高,且無法預(yù)防[2-3]。 目前普遍認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要是與T 細(xì)胞異常活化相關(guān),其中輔助T 細(xì)胞Th1、Th17 及其相關(guān)因子IFN-γ、TNF-α、IL6、IL23、IL17 和IL22 等以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞Treg 已先后發(fā)現(xiàn)成為影響銀屑病的關(guān)鍵因子,然而,這些因子在銀屑病中的具體作用機(jī)制并未完全闡明或存在爭議[4-5]。 此外目前也有報道認(rèn)為B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能紊亂在銀屑病疾病進(jìn)展過程中起著重要作用[6-7]。 然而其他免疫細(xì)胞是否與T 細(xì)胞對銀屑病發(fā)病起著同樣重要的作用,是否存在其他非免疫因素對銀屑病發(fā)病有影響也值得深入探討。

近年來,大量研究表明,不同疾病機(jī)體狀態(tài)的單一或多種組織器官中ATP 酶活性能被疾病狀態(tài)所影響,生理及病理的變化在一定程度上會影響機(jī)體內(nèi)的ATP 酶的改變,從而影響ATP 酶催化ADP氧化磷酸化成ATP,進(jìn)而影響機(jī)體的能量供給[8-10]。因此,研究疾病狀態(tài)下ATP 酶活性有助于研究疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床用藥。 ATP 酶與細(xì)胞功能,繁殖密切相關(guān),而皮膚細(xì)胞過度增生是銀屑病表現(xiàn)之一,且前期有文獻(xiàn)報道銀屑病病人紅細(xì)胞中Ca2+Mg2+-ATP 酶活性下降,提示非免疫因素ATP 酶活性改變可能與銀屑病發(fā)病相關(guān)[11]。

因此本文擬通過比較不同免疫狀態(tài)小鼠Balb/c鼠(免疫細(xì)胞正常)、裸鼠(T 免疫細(xì)胞缺陷)和NOG小鼠(重度免疫細(xì)胞缺陷)在咪喹莫特誘導(dǎo)下皮膚和脾外觀及組織病理變化的不同,及其ATP 酶活性變化研究探討不同免疫細(xì)胞及非免疫因素對銀屑病發(fā)病的影響,為銀屑病發(fā)病機(jī)制的闡明提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SPF 級Balb/c 小鼠、裸鼠、NOG 小鼠各20只,體重18～22 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0011]提供,大鼠飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院SPF 級動物實驗中心[SYXK(粵)2018-0094],飼養(yǎng)溫度為(24±2)℃,相對濕度(60±10)%,采用12 h:12 h 晝夜間斷照明,動物自由飲食飲水。 動物實驗方案通過廣東省中醫(yī)院廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院試驗動物倫理委員會審批(2014001),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

咪喹莫特(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司,20030128);超微量Na+K+、Ca2+Mg2+、總ATP 酶測試盒(南京建成生物工程研究所,20170228);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo scientific 公司,ML166920);IL6、IL17、IL22、IL23 ELISA 試劑盒(美國Raybiotech 公司,EKL54698-BM,EKL54533-BM,EKL58293-BM,EKL58298-BM);氯化鈉(天津市富宇精細(xì)化工有限公司,20160524)。 Saturius BS224S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);VICTOR X5 酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer 公司);T10勻漿機(jī)(德國IKA 公司);Centrifuge 5430 離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及藥物誘導(dǎo)銀屑病動物模型的建立

Balb/c 小鼠、NOG 小鼠、裸鼠各20 只適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后均無異常后納入實驗。 每種小鼠隨機(jī)分為模型和空白2 組,每組10 只,稱重標(biāo)記。 將鼠尾根部以上長3 cm、寬2 cm 長方形皮膚上被毛除去,模型組每日上午于小鼠背部涂抹5%咪喹莫特乳膏(每只50 mg),空白組不做任何處理。

1.3.2 取材及處理

每日拍照觀察皮膚皮損情況,參照銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(PASI)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。造模5 d 后,小鼠禁食不禁水12 h,稱重,麻醉后處死。 取小鼠背部皮膚、脾,脾拍照稱重,生理鹽水沖洗皮膚和脾后分為2 份,1 份置于10%甲醛溶液固定用于HE 染色,另1 份置于-80℃保存,備用。

1.3.3 皮膚中炎癥因子的測定

取皮膚50 mg,精密稱定,按重量(g) ∶體積(mL)= 1 ∶9 的比例,加入預(yù)冷的9 倍體積蛋白裂解液,勻漿機(jī)下機(jī)械勻漿12000 r/min 離心5 min,取上清液,精密吸取100 μL 樣品加入包被好抗體的96孔板,在室溫下孵育2.5 h,棄孔中廢液后洗滌;加入100 μL 二抗,孵育1 h,棄廢液后洗滌;加入100 μL streptavidin-HRP 溶液,孵育45 min 后棄廢液洗滌;加入100 mL TMB 后避光孵育30 min;加入終止液后使用酶標(biāo)儀在450 nm 下檢測,根據(jù)制作好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組蛋白表達(dá)量差異。 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠皮膚中IL6、IL17、IL22 及IL23 蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 皮膚、脾中ATP 酶活力的測定

取皮膚和脾組織50 mg,精密稱定,按重量(g):體積(mL)= 1 ∶9 的比例,加入預(yù)冷的9 倍體積的生理鹽水,勻漿機(jī)下機(jī)械勻漿,低溫高速離心機(jī)中2000 r/min 離心10 min,取上清液(即10%的勻漿上清液),再用生理鹽水10 倍稀釋成1%,制得組織混懸液。 嚴(yán)格按照超微量Na+K+-ATP 酶、Ca2+Mg2+-ATP 酶、總ATP 酶試劑盒說明書測定酶活力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件處理,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P＜0.05 表示具有顯著性差異,兩均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 皮膚外觀、病理組織切片比較

由圖1A 可見,空白組動物均皮膚光滑,顏色正常;而造模組在涂抹咪喹莫特5 d 后,Balb/c 小鼠出現(xiàn)皮膚粗糙、紅色,起皺,觸之變硬伴斑片、嚴(yán)重起皮、脫屑;裸鼠粗糙、紅色,起皺,觸之變硬,部分起皮;NOG 小鼠皮膚紅色,起皺,皮膚稍硬,少量起皮。3 種小鼠造模組PASI 評分均顯著高于空白對照組(P＜0.05,P＜0.01),且按評分從高到低排序為Balb/c 小鼠＞裸鼠＞NOG 鼠(見圖1B)。

圖1 咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病3 種動物模型皮膚形態(tài)學(xué)改變及PASI 評分Note. Compared with the blank group, **P＜0.01.Figure 1 Skin morphological changes and PASI score of three animal models of psoriasis induced by imiquimod

皮膚HE 染色結(jié)果顯示空白組顆粒層完整,棘層較薄、基底整齊,真皮層小血管正常;3 種模型小鼠均出現(xiàn)角化過度或角化不全,棘層明顯增厚,顆粒層細(xì)胞減少或排列異常,真皮層小血管增生、擴(kuò)張,真皮乳頭向下突出,炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,且Balb/c小鼠角質(zhì)層中可見Munro 小膿瘍,按病理嚴(yán)重程度排序為Balb/c 小鼠＞裸鼠＞NOG 鼠(見圖2)。

圖2 咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病3 種動物模型組織病理改變(HE 染色)Figure 2 Histopathological changes of three animal models of psoriasis induced by imiquimod(HE staining)

2.2 皮膚中炎癥因子水平比較

與空白組比較,Balb/c 小鼠、裸鼠、NOG 小鼠模型組皮膚中IL6 蛋白表達(dá)水平均顯著升高,依次為81.7%、39.4%和37.5%(P＜0.05,P＜0.01)(見圖3A);IL17A 蛋白表達(dá)水平也均顯著升高,依次為41.0%、43.8%和46.4%(P＜0.05,P＜0.01)(見圖3B);IL22 蛋白表達(dá)水平均有升高,依次為41.0%,24.4%和18.9%,但僅Balb/c 小鼠模型組差異具有顯著性(P＜0.05)(見圖3C);IL23 蛋白表達(dá)水平也均顯著升高,增加幅度依次為53.3%、63.7%、66.4%(P＜0.05)(見圖3D)。

2.3 脾外觀、脾指數(shù)和病理組織切片比較

我們接著觀察了3 種小鼠造模前后脾外觀和病理學(xué)變化。 如圖3A 所示,我們觀察到與正常組比較,Balb/c 小鼠、裸鼠、NOG 小鼠模型組的脾均明顯增大,脾指數(shù)結(jié)果顯示其脾指數(shù)增加幅度依次為200.0%、102.2%、118.2% (P＜0.01) (見圖4A、4B)。 脾病理學(xué)結(jié)果顯示正常Balb/c 小鼠脾紅、白髓結(jié)構(gòu)清晰,生發(fā)中心清晰可見。 與Balb/c 小鼠比較,正常裸鼠脾白髓中中央動脈周圍淋巴細(xì)胞大量減少,白髓區(qū)相對變小,正常NOG 小鼠脾白髓萎縮,淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺失。 與正常組比較,Balb/c 小鼠和裸鼠模型組脾中白髓均明顯增大,生發(fā)中心不可見,紅髓區(qū)擴(kuò)張充血,NOG 小鼠模型組白髓區(qū)無明顯變化,紅髓區(qū)擴(kuò)張充血(見圖4C)。

圖3 咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病3 種動物模型皮膚中IL6、IL17A、IL22 和IL23 蛋白水平比較Note. Compared with the blank control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 3 Comparison of IL6, IL17A, IL22 and IL23 protein levels in the skin of three animal models of psoriasis induced by imiquimod

圖4 咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病3 種動物模型脾外觀、脾指數(shù)和病理組織切片比較Note. Compared with the blank control group, **P＜0.01.Figure 4 Comparison of spleen appearance, spleen index and pathological sections in three animal models of psoriasis induced by imiquimod

2.4 皮膚和脾中ATP 酶活力比較

與空白組比較,Balb/c 小鼠、裸鼠模型組皮膚中Na+K+-ATP 酶活力顯著下降,下降幅度依次為41.7%和20.0%(P＜0.05)(見圖5A);Balb/c 小鼠、裸鼠、NOG 小鼠模型組皮膚中Ca2+Mg2+-ATP 酶活力均顯著下降,下降幅度依次為40.7%、34.3%和14.2%(P＜0.05,P＜0.01)(見圖5B)。

與空白組比較,Balb/c 小鼠、裸鼠、NOG 小鼠模型組脾中Na+K+-ATP 酶活力均略有降低,但無顯著性(見圖5C);但3 種小鼠模型組脾中Ca2+Mg2+-ATP 酶活力均顯著下降,下降幅度依次為55.6%、6.8% 和17.5%(P＜0.05)(見圖5D)。

圖5 咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病3 種動物模型皮膚和脾中ATP 酶活力比較Note. Compared with the blank control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 5 Comparison of ATPase activities in skin and spleen of three animal models of psoriasis induced by imiquimod

3 討論

銀屑病是常見的以鱗屑性紅斑為臨床特點的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病,通常認(rèn)為其為免疫介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病。 本研究采用咪喹莫特對3 種不同免疫狀態(tài)小鼠誘導(dǎo)銀屑病模型由結(jié)果可知,3 種小鼠都出現(xiàn)了銀屑病病變現(xiàn)象,皮膚外觀顯示3 種小鼠均出現(xiàn)皮膚紅色,起皺,但免疫細(xì)胞無缺失的Balb/c 小鼠模型組皮膚還顯著變硬伴斑片、嚴(yán)重起皮、脫屑;T 細(xì)胞缺失的裸鼠皮膚變硬,部分起皮,重度免疫缺陷的NOG 小鼠皮膚稍變硬,僅少量起皮或不起皮。 3 種動物比較,Balb/c 小鼠銀屑病樣模型癥狀更嚴(yán)重,銀屑病樣皮損更典型,其次為裸鼠,再次為NOG 小鼠。 PASI 評分比較,Balb/c 小鼠遠(yuǎn)高于裸鼠和NOG 小鼠,裸鼠稍高于NOG 小鼠。 病理切片結(jié)果顯示3 種動物模型均出現(xiàn)角化過度或不全,棘層增厚,真皮乳頭向下突出,炎細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象,但與皮膚外觀形態(tài)改變一致,Balb/c 小鼠的各項病理指標(biāo)變化較裸鼠和NOG 小鼠更顯著。 3 種模型動物各炎癥因子水平均升高,3種動物之間IL17 和IL23 因子水平差異不明顯,但I(xiàn)L6 和IL22 變化趨勢與外觀形態(tài)和病理切片結(jié)果一致,Balb/c 小鼠＞裸鼠＞NOG 小鼠,以上結(jié)果均表明體內(nèi)有T 細(xì)胞的Balb/c 小鼠比體內(nèi)T 細(xì)胞缺失的裸鼠和NOG 小鼠更易誘導(dǎo)為典型的銀屑病樣癥狀,提示T 細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中起最為關(guān)鍵的作用,且銀屑病的誘發(fā)是多種T 細(xì)胞相關(guān)因子綜合作用的結(jié)果。 此外僅T 細(xì)胞缺失的裸鼠比重度免疫缺陷的NOG 小鼠銀屑病樣癥狀顯著,提示其它免疫細(xì)胞活化也對銀屑病發(fā)病有促進(jìn)作用。 而由于重度免疫缺陷NOG 小鼠仍然可以誘發(fā)出銀屑病,提示在銀屑病發(fā)病過程中還存在一些非免疫因素的刺激因素。 脾是體內(nèi)最大的免疫器官,主要由白髓和紅髓組成,其中白髓由密集的淋巴細(xì)胞構(gòu)成,特別是T細(xì)胞和B 細(xì)胞,分別占25%和55%,是機(jī)體發(fā)生特異性免疫的主要場所[12]。 本實驗結(jié)果顯示3 種小鼠的脾均明顯變大,病理結(jié)果顯示造模后Balb/c 小鼠和裸鼠的白髓區(qū)明顯增大,其中淋巴細(xì)胞明顯增多,進(jìn)一步證實免疫細(xì)胞特別是T、B 細(xì)胞活化是銀屑病發(fā)病的重要因素。 但是NOG 模型小鼠的白髓與正常組相比無明顯差異,但與其余2 種模型小鼠一樣出現(xiàn)了紅髓擴(kuò)張充血現(xiàn)象,紅髓儲血、濾血的主要場所,當(dāng)濾血功能異常時,機(jī)體內(nèi)異物與毒素的排出受到阻礙,該結(jié)果也進(jìn)一步提示存在一些非免疫細(xì)胞活化因素與銀屑病發(fā)病有關(guān)。

ATP 是體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動所需能量的直接來源,被譽為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的“分子貨幣”,用來儲存和傳遞化學(xué)能。 ATP 酶是一類介導(dǎo)主動轉(zhuǎn)運的膜蛋白,可將細(xì)胞內(nèi)的 ATP 水解為ADP,利用高能磷酸鍵貯存的能量完成離子的跨膜轉(zhuǎn)運,其中重要的是 Na+K+-ATP 酶和Ca2+Mg2+-ATP酶[13]。 當(dāng)Na+K+-ATP 酶和Ca2+Mg2+-ATP 酶活性降低時,細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+外流減少,胞漿內(nèi)Na+和Ca2+大量積累它打破了生物膜上跨膜轉(zhuǎn)運的平衡,進(jìn)而影響物質(zhì)的交換和毒素的排出[14]。 我們的研究顯示3 種銀屑病模型小鼠皮膚和脾中Ca2+Mg2+-ATP 酶和Na+K+-ATP 酶活性均降低,提示機(jī)體內(nèi)物質(zhì)交換以及毒素排出受到了阻礙,該結(jié)果與脾病理結(jié)果中紅髓功能可能存在異常的結(jié)果相符,而其中深入的內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上可見,本實驗通過采用咪喹莫特對3 種不同免疫狀態(tài)小鼠誘導(dǎo)銀屑病模型,整體直觀的驗證了T 細(xì)胞異常活化在銀屑病發(fā)病中關(guān)鍵性的作用,但其他多種免疫細(xì)胞活化也在銀屑病發(fā)病中有重要作用,此外在后續(xù)研究中我們還需關(guān)注可能誘導(dǎo)銀屑病發(fā)病的非免疫因素,有助于銀屑病發(fā)病機(jī)制的全面深入闡明。