樹鼩睪丸間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)及寨卡病毒感染特性的研究

鄧 偉金亮子奎秀瑩王文廣李 娜仝品芬代解杰*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650031;2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,昆明 650091;3.昆明醫(yī)科大學(xué),昆明 650500)

寨卡病毒(Zika virus,Zikv)為單股正鏈RNA 病毒,屬于黃病毒的一種,研究表明Zikv 感染可導(dǎo)致睪丸發(fā)生炎癥,引起睪丸內(nèi)部結(jié)構(gòu)受損及細胞大量死亡[1],對男性生殖健康帶來潛在威脅。 研究發(fā)現(xiàn)Zikv 感染可導(dǎo)致小鼠睪丸間質(zhì)充血、睪酮水平下降、睪丸間質(zhì)細胞(Leydig cells,LCs)產(chǎn)生大量炎癥因子及趨化因子,說明LCs 與Zikv 感染睪丸密切相關(guān),但具體感染機制尚不明確。

LCs 主要分布于生精小管之間,是睪丸主要細胞類型之一[2],在毒理學(xué)、藥理學(xué)及生殖遺傳學(xué)等研究方面具有十分重要的應(yīng)用意義,是睪丸中唯一能夠分泌睪酮的細胞[3],可促進精子的發(fā)生和男性生殖器官發(fā)育,以及維持第二性征和性功能,大約95%的雄性激素由其分泌[4]。 研究發(fā)現(xiàn)LCs 數(shù)量缺少會導(dǎo)致雄性激素缺乏[5],體外分離培養(yǎng)純度高、活性強的LCs 可更好的研究其相關(guān)機制和特性。

LCs 占睪丸細胞總數(shù)的2%～4%[6],數(shù)量較少且純化難度較大,目前對于LCs 的分離培養(yǎng)主要有機械分離法[7]、組織塊貼壁法[8]、酶消化法[9]、percoll 密度梯度離心法[10]等幾種方法,機械分離法對細胞損傷較大,組織塊貼壁法雜細胞太多且周期較長,percoll 密度梯度離心法得到的細胞仍存在其他雜細胞,并且采用單一方法難以實現(xiàn)LCs 分離培養(yǎng)。

樹鼩(Tupaiabelangeri,tree shrew)在生理、生化、新陳代謝、解剖結(jié)構(gòu)以及基因組[11]等生物學(xué)特性比嚙齒類更接近于非人靈長類,已廣泛應(yīng)用于人類疾病模型的研究,包括病毒感染模型[12]、腫瘤模型[13]、呼吸系統(tǒng)疾病模型[14]和神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型[15]等。 本文旨在參考其他動物L(fēng)Cs 培養(yǎng)與純化方法的基礎(chǔ)上,采用酶消化、percoll 密度梯度離心及差異貼壁等分離純化方式結(jié)合,建立樹鼩LCs 原代培養(yǎng)和純化方法,為利用樹鼩開展相關(guān)研究提供新的實驗材料;通過Zikv 對LCs 的感染特性研究,建立Zikv 感染的睪丸細胞模型,為研究Zikv 感染雄性生殖系統(tǒng)的相關(guān)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

2 只3 月齡普通級雄性滇西亞種樹鼩,體重95～110 g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心飼養(yǎng)繁殖[SCXK(滇)K2018-0002];所有實驗均在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心進行[SYXK(滇)K2018-0002],本實驗經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所審批(DWSP202008014),并遵循實驗動物使用的3R 和福利倫理原則。

1.1.2 病毒株

Zikv GZ01 株,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院秦成峰教授饋贈。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12 培養(yǎng)基(Gibco 公司);胎牛血清(FBS,以色列Biological Industries);IV 型膠原酶(北京索萊寶);PBS(美國Hyclone);0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶、青-鏈霉素(美國Gibco);無血清凍存液(美國Cyagen);Testosterone ELISA kit(上海碧云天);3β-HSD 小鼠單克隆IgG 抗體(Santacruz);熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG(英國Abcam);病毒RNA 提取試劑盒QIAamp ? Viral RNA Mini Kit(德國Qiagen);One Step Prime Script TM RT-PCR Kit(日本TaKaRa)。 生物安全柜和CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Forma);臺式高速離心機(美國Beckman);細胞計數(shù)儀(美國Bio-Rad);倒置熒光相差顯微鏡(日本Nikon)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹鼩LCs 分離、純化

取3 月齡的雄性樹鼩,腹腔注射0.4 mL 3%戊巴比妥鈉麻醉處死后,無菌取出睪丸,75%乙醇中浸泡20 s,取出后用PBS 沖洗兩遍去乙醇。 移入Heraguard ECO 超凈工作臺,用眼科剪和鑷子去除睪丸的白膜、附睪及血管,小心取出睪丸實質(zhì)組織,置于裝有D-Hanks 液的無菌培養(yǎng)皿中,洗滌2 遍。用眼科剪將其剪碎后轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)。 加入1 mg/mL IV 膠原酶,放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育30 min,1000 r/min 離心5 min,加入0.25%胰酶消化10 min后,用含血清的培養(yǎng)基終止消化,吸管吹打混勻,將細胞懸液放入40 目細胞篩網(wǎng)中過濾,使之分散成單個細胞。 收集到15 mL 離心管中,1000 r/min 離心5 min,棄上清,加入DMEM/F12 培養(yǎng)液重懸細胞,重復(fù)離心1 次。

純化方法采用percoll 密度梯度離心法[16]:將分離得到的細胞懸液加于不同密度梯度的Percoll 分離液上,從分離管底部向上密度依次為60%、37%、26%、21%,4℃、3000 r/min 離心30 min。 收集37%和60%之間的細胞,后用DMEM/F12 培養(yǎng)液稀釋,再將懸液以1500 r/min 離心10 min,沉淀加入含胎牛血清的培養(yǎng)液,搖勻得細胞懸液。 將分離純化得到的細胞懸液計數(shù),后稀釋成每毫升1×106個濃度的細胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基配方為DMEM/F12 培養(yǎng)基加10% FBS、1%青-鏈霉素。 此時細胞中還含有少量支持細胞和其他雜細胞,根據(jù)間質(zhì)細胞和支持細胞貼壁時間不同,在傳代后6 h 更換培養(yǎng)液以去除雜細胞達到純化目的,第2 代和第3 代的細胞仍按此步驟進一步純化。

1.3.2 樹鼩LCs 免疫熒光鑒定

間質(zhì)細胞鑒定采用3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)鑒定法[17]。 將純化后的第3 代細胞接種在24孔板中,待細胞長滿70%～80%時,吸去培養(yǎng)基,PBS洗3 次,每次3 min,加入4%多聚甲醛固定20 min,PBS 清洗3 次,每次3 min,加入0.5% Triton X-100室溫孵育20 min,PBS 清洗3 次,每次3 min;5%山羊血清封閉30 min,PBS 清洗3 次,每次3 min,加入稀釋好的鼠源性3β-HSD 一抗(稀釋比例1 ∶50),同時設(shè)置對照孔(加PBS),4℃孵育過夜,將孔板用PBS 清洗3 次,每次3 min;避光條件下加入羊抗鼠熒光二抗(1 ∶400)室溫孵育1 h,PBS 清洗3 次,每次3 min;加入DAPI 染色液孵育2 min,PBS 清洗3次,每次3 min,置于熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.3.3 樹鼩LCs 增殖曲線測定

將純化后的第3 代LCs 消化成細胞懸液,按每孔1×105個接種于48 孔板,設(shè)置1～7 d 共7 個組,每組設(shè)置2 個副孔,從接種時間起每隔24 h 吸去培養(yǎng)液并消化計數(shù),取平均值,以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細胞密度為縱坐標(biāo)繪制增殖曲線。

1.3.4 樹鼩LCs 分泌睪酮水平測定

采用Testosterone ELISA kit 檢測睪酮水平,將培養(yǎng)第4 代至第7 代的LCs 按1×105個每孔接種于12 孔板的培養(yǎng)皿上,之后每24 h 更換培養(yǎng)液,分別在培養(yǎng) 24、48 h 后收取培養(yǎng)液,每個時間點收取3個樣本測定睪酮含量,取平均值。

1.3.5 寨卡病毒感染實驗

將對數(shù)生長期的第3 代樹鼩LCs 用0.25%胰蛋白酶消化重懸,以密度為每毫升1×105個每孔接種于24 孔板內(nèi),24 h 后將寨卡病毒(滴度1×106copies/mL)以MOI=1 感染細胞,在感染后2、6、12、24、36、48、72 和96 h 時間點收集細胞和上清液,QIAamp?Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取核酸,RTqPCR 檢測病毒載量,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,并以對寨卡病毒易感的Vero 細胞按相同步驟作對比實驗。

感染細胞后睪酮水平測定:以上述方法感染細胞2 h 后,PBS 洗掉未吸附的病毒,添加1 mL 細胞培養(yǎng)液,分別在12、24、36、48 h 收集感染組和對照組培養(yǎng)液(不同時間段感染組和對照組樣品收集均為相應(yīng)的同一個孔,每個時間點收取3 個樣本),同時補加1 mL 培養(yǎng)液,競爭法酶聯(lián)免疫吸附測定檢測睪酮水平,取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用兩兩獨立樣本的t檢驗分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩LCs 形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

經(jīng)percoll 密度梯度離心分離后的細胞6 h 后開始貼壁,呈不規(guī)則的形態(tài),培養(yǎng)至第3 天后細胞開始長出觸角(圖1A),培養(yǎng)至7 d 進行第1 次傳代,待傳代細胞培養(yǎng)6 h 后換液,去除未貼壁的雜細胞;傳至第3 代后細胞活性開始增高,能夠快速增殖,細胞呈典型的拉網(wǎng)狀(圖1B),之后根據(jù)密度1 ∶3～5 傳代即可。 傳至第6 代后,細胞形態(tài)略微有點變化,細胞長度稍微變短,寬度增加,但仍有觸角伸出(圖1C)。 隨著細胞數(shù)量的增多,細胞間的界限和觸角不在明顯,從無序狀變?yōu)榧y理狀(圖1D),細胞可穩(wěn)定傳至15 代以上。

細胞鑒定:3β-羥類固醇脫氫酶是睪酮合成的關(guān)鍵酶之一,是公認(rèn)的LCs 鑒定指標(biāo)。 3β-HSD 免疫熒光鑒定顯示,細胞均為陽性表達,證明所分離培養(yǎng)的細胞為LCs,且細胞純度高達98%以上,見圖2。

圖2 樹鼩睪丸間質(zhì)細胞3β-HSD 免疫熒光鑒定Note. 3β-HSD, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase. DAPI, 4’, 6-diamidino-2-phenylindole. Merge, Combination of 3β-HSD and DAPI.Figure 2 3β-HSD lmmunofluorescence ldentification of Leydig cells in tree shrew

2.2 樹鼩LCs 增殖曲線的測定

睪丸間質(zhì)細胞生長曲線結(jié)果顯示,在培養(yǎng)前3 d增殖迅速,活力較強,為對數(shù)增長期,3～5 d 為增殖平臺期。 提示可選擇第3 天的細胞進行后續(xù)實驗,見圖3。

圖3 樹鼩睪丸間質(zhì)細胞增殖曲線Note. Number of cells on days 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 after LCs inoculation.Figure 3 Tree shrew testicular Leydig cells proliferation curve

2.3 樹鼩LCs 分泌睪酮活性檢測

酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測結(jié)果顯示,第4 代至第7 代的LCs 在培養(yǎng)48 h 內(nèi)能夠分泌睪酮,分泌量在1.1～1.3 ng/mL 左右,說明分離的LCs 具有持續(xù)分泌睪酮的能力,見圖4。

圖4 不同代次樹鼩睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌能力測定Note. P4, P5, P6, and P7 represent the 4th, 5th, 6th and 7th generations of tree shrew LCs, respectively. Comparison of testosterone secretion in 0～24 h and 24～48 h from the 4st generation to the 7th generation LCs.Figure 4 Determination of testosterone secretion capacity of tree shrew LCs at different passages

2.4 樹鼩LCs 感染寨卡病毒后形態(tài)學(xué)觀察

感染結(jié)果表明,36 h 時LCs 已經(jīng)大量病變,96 h 幾乎觀察不到活細胞,而96 h 時對照組細胞形態(tài)正常;Vero 細胞在感染96 h 后才能觀察到輕微的細胞病變,初步說明LCs 比Vero 更易感染Zikv,見圖5。

圖5 寨卡感染樹鼩睪丸間質(zhì)細胞和Vero 細胞后形態(tài)學(xué)觀察Note. A, LCs were infected with Zikv for 36 h. B, LCs infected for 96 h. C, LCs 96 h control group. D, Vero infected with Zikv for 36 h. E,Vero infection 96 h. F, Vero 96 h control group.Figure 5 Morphological observation of testicular Leydig cells and Vero cells in tree shrews infected by Zikv

2.5 細胞和上清液病毒載量測定

RT-qPCR 結(jié)果表明,感染2 h 后LCs 細胞中病毒載量可達1.93×105copies/mL,且6 h 內(nèi)持續(xù)上升達到峰值2.15×105copies/mL,36 h 后由于細胞死亡裂解病毒載量逐漸下降,細胞上清液中病毒載量在感染12 h 后迅速上升,在48 h 后達到峰值1.3×105copies/mL;Vero 細胞在感染36 h 后細胞中病毒載量才開始增加,到96 h 病毒載量仍在上升,但病毒拷貝數(shù)小于同期的LCs,表明Zikv 能夠在LCs 中迅速增殖并釋放出子代病毒,見圖6。

圖6 寨卡病毒感染睪丸間質(zhì)細胞和Vero細胞后病毒增殖曲線Note. Viral loads in cells and supernatants of LCs and Vero at 2, 6, 12,24, 36, 48, 72 and 96 h after infection with Zikv.Figure 6 Virus proliferation curve after Zikv infection of testicular Leydig cells and Vero cells

2.6 Zikv 感染樹鼩睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌能力測定

ELISA 睪酮水平測定結(jié)果顯示,正常培養(yǎng)的LCs 在前36 h 內(nèi),其睪酮分泌量為1.168～1.352 ng/mL,而感染寨卡病毒36 h 內(nèi)細胞睪酮分泌量為1.051～1.156 ng/mL,略低于正常培養(yǎng)的細胞,并且在感染36～48 h 內(nèi)睪酮分泌量下降到0.122 ng/mL,而正常培養(yǎng)的細胞仍然具有正常分泌睪酮的能力,分泌量為1.133 ng/mL。 并且細胞數(shù)量測定結(jié)果顯示,感染組和對照組的的活細胞數(shù)量在測定時間內(nèi)無顯著差異,表明Zikv 感染樹鼩LCs 能夠使其睪酮分泌能力下降甚至缺失,見圖7、8。

圖7 感染組與對照組活細胞數(shù)量的測定Note. Comparison of the number of viable cells of LCs with the normal control group at 12, 24, 36 and 48 h after infection with Zikv.Figure 7 Determination of the number of viable cells in the infected group and the control group

圖8 細胞感染后睪酮水平測定Note. Comparison of tes tosterone secretion content of LCs at 0～12, 12～24, 24～36, 36～48 h after infection with Zikv.Compared with the normal control group, *P＜0.05.Figure 8 Determination of testosterone levels after cell infection

3 討論

Zikv 不僅能夠感染神經(jīng)系統(tǒng),研究表明睪丸也是Zikv 感染的主要靶器官,Zikv 病毒能夠在睪丸中大量增殖和復(fù)制,引起睪丸結(jié)構(gòu)破壞及大量細胞死亡,從而導(dǎo)致雄性性功能受損。 本實驗利用分離培養(yǎng)的樹鼩LCs 作為Zikv 感染的細胞模型,研究其感染特性,為探討Zikv 入侵雄性生殖系統(tǒng)的作用機制提供基礎(chǔ)。

樹鼩睪丸中LCs 的數(shù)量稀少,其分離純化方法尤為關(guān)鍵。 實驗使用3～4 月齡的樹鼩作為實驗材料,這段時期正處于樹鼩的青春期,細胞活力旺盛,具備良好的睪酮分泌能力;其次,此時樹鼩的睪丸白膜,血管易分離,能有效去除原代培養(yǎng)中成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞污染,更容易成功分離細胞。

傳統(tǒng)的percoll 密度梯度法雖然能夠去除大部分雜細胞,但仍然有支持細胞存在,本研究多次實驗發(fā)現(xiàn)在支持細胞和LCs 共同培養(yǎng)時,支持細胞為優(yōu)勢細胞,單一的percoll 密度梯度法雖然能夠成功得到大部分LCs,但培養(yǎng)后期純度逐漸降低,差異貼壁法能夠有效去除雜細胞而達到進一步純化目的。本實驗通過percoll 密度梯度離心得到較為純化的LCs,根據(jù)LCs 和支持細胞的貼壁速率不同,睪丸間質(zhì)細胞先貼壁[18],待原代細胞培養(yǎng)6～7 d 時可進行第1 次差速貼壁純化,在傳代6 h 后換一次液去除還沒貼壁的細胞,按此操作傳至第3 代后基本無雜細胞,并且活力旺盛,增殖迅速,3β-HSD 免疫熒光鑒定細胞結(jié)果表明純度高達98%。 此外,酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果表明所得到的LCs 具備連續(xù)分泌睪酮能力,與Risberidge 等[19]報道的結(jié)果一致。

本實驗結(jié)合Percoll 密度梯度離心和差速貼壁法對LCs 進行純化,此方法與傳統(tǒng)的Percoll 密度梯度純化方法相比更能達到純化目的,有效去除了雜細胞,使LCs 在培養(yǎng)過程有效避免了優(yōu)勢貼壁細胞(支持細胞)的排擠,實現(xiàn)了LCs 的長期培養(yǎng);培養(yǎng)基采用DMEM/F12 培養(yǎng)基加10% FBS、1%青-鏈霉素,該培養(yǎng)基配制方法簡單,與傳統(tǒng)的LCs 培養(yǎng)基相比無需添加生長因子及其他成分,節(jié)約了培養(yǎng)時間和成本。

臨床資料表明Zikv 可感染男性生殖系統(tǒng)中的多個器官并長期潛伏,其中睪丸是主要的靶器官,有研究人員曾以人類睪丸組織進行Zikv 感染實驗,但因多方面原因?qū)е略擁椦芯渴　?目前用于Zikv研究的動物模型主要有小鼠、雞胚、恒河猴、樹鼩等,雞胚與人類結(jié)構(gòu)相差甚遠,恒河猴是較為理想的實驗動物,但在恒河猴感染Zikv 的研究主要集中于神經(jīng)系統(tǒng)方面,當(dāng)前關(guān)于Zikv 感染睪丸的研究主要以小鼠為主,但小鼠大多需要干擾素拮抗處理后才能成功感染Zikv。 研究表明樹鼩對Zikv 易感,且不需要拮抗處理,在Zikv 感染樹鼩的研究中發(fā)現(xiàn)病毒能夠在睪丸中大量復(fù)制,免疫組化實驗結(jié)果表明Zikv 主要集中在LCs[20],但未進一步在細胞水平上進行驗證。

多項研究表明LCs 是Zikv 感染的主要靶細胞[21],Zikv 感染免疫缺陷型小鼠可導(dǎo)致雄性小鼠睪丸萎縮、LCs 數(shù)量減少、睪酮水平及與睪酮產(chǎn)生相關(guān)的基因表達水平下降,阻礙精子成熟、睪丸萎縮;Zikv 也能夠在體外培養(yǎng)的小鼠LCs 中高效復(fù)制。 本實驗首次使用Zikv 感染樹鼩LCs,發(fā)現(xiàn)6 h 內(nèi)病毒迅速增殖和復(fù)制,36 h 后細胞開始大量死亡,證明樹鼩LCs 對Zikv 易感;ELISA 結(jié)果表明感染后能導(dǎo)致LCs 睪酮分泌能力下降甚至缺失。 這些實驗結(jié)果與已報道的Zikv 感染睪丸的研究結(jié)論相輔證,提示Zikv 感染LCs 可能是引起睪丸損傷及不育的主要原因之一,表明樹鼩LCs 可作為Zikv 感染的體外細胞模型。

綜上所述,本實驗采用兩步酶消化、percoll 密度梯度離心結(jié)合差速貼壁法能夠獲得產(chǎn)量高、活性強、可連續(xù)傳代和穩(wěn)定增殖的樹鼩LCs,為樹鼩LCs體外分離培養(yǎng)進行了實驗性探索,成功建立樹鼩LCs 體外分離培養(yǎng)方法;并利用寨卡病毒感染樹鼩LCs,定量檢測病毒增殖情況和睪酮分泌水平,證明Zikv 可成功感染樹鼩LCs,可建立寨卡病毒感染樹鼩間質(zhì)細胞模型,為寨卡病毒感染導(dǎo)致雄性睪丸損傷及不育的致病機制提供研究基礎(chǔ)。