MMP-9、TIMP-1 水平變化參與FIRS 早產兒心肌損傷的機制研究

閆祎煒江 蓮*李 梅張文浩張文婷王曉玲張原蘇張會芬

(1.河北醫科大學第四醫院兒科,石家莊 050000;2.河北醫科大學第四醫院病理科,石家莊 050000)

心肌損害是胎兒炎癥反應綜合征(fetal inflammatory response syndrome,FIRS)的并發癥之一,在成人研究中近40%膿毒癥患者可出現不同程度心肌損傷[1]。 心肌損傷起病隱匿,臨床表現多樣,早期無特異性預測指標,容易漏診,以致延遲治療、預后不良。 心肌損傷在早產兒中發病率約30%左右,而在FIRS 早產兒中可上升至46.8%,嚴重者可并發心律失常(發生率約4.28%),死亡率0.6%～1%[2]。 因此,FIRS 患兒心肌損傷的早期診斷尤為重要,部分學者積極探尋高診斷效能的心肌損傷標志物[3]。 但是,FIRS 所致心肌損傷具體機制及特異性治療藥物尚無明確結論。 既往文獻表明,膿毒癥大鼠模型中,可檢測到心臟組織基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein 9,MMP-9)水平顯著升高,并上調肌鈣蛋白酶,過度降解肌鈣蛋白,誘發心肌損傷[4]。 雖然FIRS 與全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的病程進展相近,但是MMP-9 及其抑制劑金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的水平變化是否參與FIRS 介導的心肌損傷尚不明確。 本研究臨床驗證MMP-9 及TIMP-1 表達水平,并構建FIRS 小鼠模型,探尋FIRS 誘發心肌損害的具體機制,為臨床診治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

采用清潔級10 周齡KM 小鼠45 只購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2018-004],雄鼠15 只,體重分布35～40 g,雌鼠30 只,體重分布30～35 g。飼養和實驗于河北醫科大學第四醫院動物實驗中心[SYXK(冀)2018-001],本實驗符合3R 原則,經河北醫科大學第四醫院實驗動物倫理委員會審核通過(IACUC-4thHos Hebmu-2019006)。

1.1.2 研究人群

本臨床部分研究人群和作者既往發表論文《FIRS 早產兒臍血MMP-9、TIMP-1 水平變化及其與肺損傷關系的研究》相同,但是研究方向不同[5]。 研究人群納入連續生產的早產兒共118例,納入時間區間為2018 年5 月到2019 年12 月。依據是否符合FIRS 診斷標準[6]分為FIRS 組(n=61)和非FIRS 組(n=57)。 其中FIRS 組男性32人,女性29 人,平均孕周為(29.35±1.44)周,出生體重為(1489±178)g,1 min Apgar 評分為(7.28±1.42)分,5 min Apgar 評分為(8.59±1.39)分,10 min Apgar 評分為(9.01±1.26)分;非FIRS 組男性30 人,女性27 人,平均孕周為(29.29±1.51)周,出生體重為(1482±169)g,1 min Apgar 評分為(7.32 ± 1.34) 分,5 min Apgar 評分為(8.72 ±1.26)分,10 min Apgar 評分為(9.12±1.32)分。兩組新生兒基線資料無統計學差異(P＞0.05)。研究方案經河北醫科大學醫學倫理委員會審核通過(2020004)。

1.2 主要試劑與儀器

人血清ELISA 試劑盒(IL-6、MMP-9、TIMP-1、CRP),來源中國艾萊薩生物科技有限公司;維甲酸(retinoic acid,RA),來源中國山東良福制藥;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),來源美國Sigma 公司;瑞姬氏染色液,來源中國溫州康泰生物科技公司。 離心機(YXI-2),來源日本三洋公司,超低溫冰箱購(-80℃),來源日本SANYO 公司;顯微鏡(CX-21)來源日本OLYPUS 公司;熒光定PCR 儀(型號:Mx3000P),來源美國Agilent 公司;全自動酶標檢測儀,來源美國VERS Amax 公司;電熱恒溫水浴箱(型號:JY-17-1),來源中國上海森信實驗有限公司;蛋白分析(型號:Au2700),來源日本OLYPUS 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 臨床實驗部分

通過ELLSA 法檢測臍血中的白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)水平。 所有入組新生兒通過病房治療及門診定期隨訪,每周隨訪1 次,隨訪至出生后28 d,明確是否發生心肌損傷結局。

新生兒心肌損傷診斷標準參照[7]執行,共納入包括心肌酶、肌鈣蛋白在內的兩個必要診斷指標,以及心電圖、超聲心動圖兩個輔助診斷指標。 詳見如下:①心肌酶升高(天冬氨酸轉移酶＞25 U/L 和/或乳酸脫氫酶＞407 U/L 和/或肌酸激酶＞725 U/L和/或肌酸激酶同工酶＞39 U/L);②肌鈣蛋白升高(心肌肌鈣蛋白I＞1.12 μg/L 和/或心肌肌鈣蛋白T＞0.14 μg/L);③心電圖異常(心動過緩、心律不齊等改變);④超聲心動圖異常(心臟收縮功能和射血功能減退等)。

1.3.2 動物實驗部分

(1)實驗分組

實驗分組根據是否為FIRS 小鼠及不同藥物干預,隨機分為3 組,詳細如下:FIRS 組為LPS 構建FIRS 小鼠(模型構建詳見下文)組、RA 組為FIRS小鼠+RA 組、NS 組為非FIRS 組(空白對照,生理鹽水)。

(2)構建FIRS 小鼠動物模型

FIRS 小鼠動物模型構建FIRS 小鼠模型構建參考國外學者[8-9]進行。 飼養1 周將雌雄小鼠按2 ∶1合籠,次日觀察到陰栓的雌鼠視為懷孕第1 天。 孕15 d 時對FIRS 組及RA 組小鼠進行羊膜囊內注射LPS(USA,sigma,0.25～2.5 μg/sac),總量不超過100 μg/kg,NS 組注射等量生理鹽水。 注藥后觀察孕鼠感染、流產等征象,其中流產率10.00%。 建模成功標志:孕鼠分娩后進行胎盤組織鏡下觀察,可見炎細胞大量浸潤、正常絨毛結構消失,伴隨水腫及部分纖維化。 本實驗小鼠建模成功建模成功率為83.73%。

(3)藥物干預

藥物干預對上述3 組小鼠進行不同干預,RA組建模成功后于孕17 d 開始,通過MMP-9 抑制劑維甲酸(retinoic acid,RA)(山東良福制藥)灌胃,劑量50 μg/(kg·d),至分娩。 FIRS 組、NS 組在孕17 d 使用和RA 組等量生理鹽水(normal saline,NS)灌胃,至分娩。

(4)留取標本

組織留取及指標觀察從3 組中各隨機取3 只孕19 d 孕鼠,行剖宮產手術,留取胎鼠的胎盤、心臟組織,余孕鼠待自然分娩,分別于產后1、7、14 d 處死仔鼠(每組每時間點n=10 只),均留取心臟組織,部分甲醛溶液中固定后石蠟包埋用于HE 染色,余于液氮中迅速冷凍后置-80℃保存用以RT-PCR 檢測。

(5)HE 染色觀察心肌病理損傷

胎盤及小鼠心臟組織HE 染色鏡檢:采集的胎盤及心臟組織中性甲醛中固定4 h 后進行制片、HE染色。

(6)RT-PCR 檢測IL-6、MMP-9 及TIMP-1 表達量

小鼠心臟組織中IL-6、MMP-9 及TIMP-1 表達量的RT-PCR 測定:將留取的心臟組織中提取總RNA,并進行RNA 純度及完整性測定。 樣本進行反轉錄,其中引物設計如表1。 并進行實時熒光定量PCR 擴增,讀取相對表達量。

表1 相關指標擴增引物序列Table 1 Amplification primer sequence of related indicators

1.4 統計學方法

數據通過SPSS (21. 0, IBM) 及R 軟件(RStudio 2021. 09. 0 Build 351)進行統計分析,相關矩陣圖通過R 軟件(RStudio 2021. 09. 0 Build 351)進行繪制。 計量資料采用t檢驗進行分析,多組均數的比較采用重復測量方差分析,相關性分析采用Spearman’s 線性相關。 計數資料比較采用卡方檢驗或Fisher 確切概率法進行。α=0. 05 為檢驗水準。

2 結果

2.1 早產兒臍血中IL-6、MMP-9、TIMP-1 及M/T比值表達水平

FIRS 組IL-6、MMP-9、TIMP-1 及M/T 比值分別為(38.53 ± 9.01) pg/L、 (42.27 ± 12.53) ng/L、(110.48±17.06)ng/L、(38.30±9.93)%和非FIRS組(對照組)比較,均高于對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05),詳見表2。

表2 不同組別臍血IL-6、MMP-9、TIMP-1、M/T 比值水平比較(n=118)Table 2 Comparison of cord blood IL-6, MMP-9, TIMP-1, M/T ratio levels in different groups

2.2 不同組別早產兒心臟損傷結局比較

隨訪期間,FIRS 組患兒心肌損害發生17 例,非FIRS 組心肌損傷發生3 例,FIRS 組心肌損傷率(27.87%)顯著高于非FIRS 組(5.26%),差異具有統計學意義(P=0.001),詳見表3。

表3 不同組別新生兒心肌損傷發生率比較(n=118)Table 3 Comparison of incidence rates of neonatal myocardial injury in different groups

2.3 胎/仔鼠心臟病理組織改變

分別在小鼠孕19 d、產后1 d、產后7 d、產后14 d 4 個時間節點獲取胎/仔鼠心臟標本,制備HE染色組織切片。 結果顯示:結果可見FIRS 組心肌組織可見明顯出血灶及水腫,心室壁變薄;RA 干預后與FIRS 組病變相似心臟結構變化,但是程度明顯減輕,NS 組未見明顯心臟組織結構改變,見圖1。

圖1 不同時間點胎/仔鼠心臟組織切片圖(HE 染色)Note. A1～D1, Control group (NS group)mouse heart tissue at 19 days of gestation, 1, 7, and 14 days after delivery. A2～D2, FIRS group at 19 days of gestation, 1 after delivery heart tissue of mice at day 7, 14 days after delivery. A3～D3, RA group mouse heart tissue at 19 days of gestation, 1, 7, and 14 days after delivery. The positions marked by the red arrows, Typical parts of pathological manifestations. Arrows of A2 and A3 point to two different hearts on the same slide, A2, FIRS group. A3, RA group.Figure 1 Tissue sections of fetal/offspring hearts at different time points (HE staining)

2.4 不同日齡組別胎/仔鼠心臟組織IL-6、MMP-9、TIMP-1 表達水平

FIRS 組小鼠在孕19 d、產后1 d、產后7 d、產后14 d 4 個時間節點IL-6、MMP-9、TIMP-1 mRNA 表達量及M/T 比值顯著高于對照組,差異具有統計學意義,P＜0.05。 RA 組通過RA 干預后,相同時間節點IL-6、MMP-9 mRNA 表達量及M/T 比值顯著高于對照組(P＜0.05),但是低于相同時間節點的FIRS 組(P＜0.05),詳見表4。

表4 不同組別不同胎齡下指標表達量比較(n=10)Table 4 Comparison of index expression in different groups and gestational ages

2.5 FIRS 小鼠心臟組織IL-6 與MMP-9、TIMP-1及M/T 的相關性分析

對FIRS 小鼠心臟組織中IL-6、MMP-9、TIMP-1及M/T 進行相關性分析,結果顯示:IL-6 與MMP-9[rMMP-9=0.82,95%CI(0.69,0.90)]、TIMP-1[rTIMP-1=0.66,95%CI(0.44,0.81)]及M/T[rM/T=0.36,95%CI(0.06,0.61)]呈正相關,見圖2。

圖2 小鼠心臟組織中IL-6 與MMP-9、TIMP-1 及MMP-9 / TIMP-1 比值相關矩陣圖Note. Blue dot, Positive correlation. Red dot, Negative correlation.Number of sitting angles, Correlation coefficient.Figure 2 Correlation matrix of IL-6 with MMP-9, TIMP-1 and MMP-9 / TIMP-1 ratio in mouse heart tissue

3 討論

FIRS 是胎兒時期較為嚴重的炎癥反應疾病,其主要機制為胎兒體內大量炎癥因子釋放,并激活體內不可控炎癥級聯反應,最終可能導致患兒的不同臟器損傷[10]。 Tang 等[11]人進行的一項納入了10項研究共計1116 例患者的Meta 分析,評價了FIRS導致的新生兒不良結局,結果顯示:FIRS 可導致新生兒早發敗血癥(neonatal early-onset sepsis,EOS)、支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)等相關疾病。 此外,尚有報道證實FIRS 可誘導新生兒的心肌損傷[2,12]。 本研究結果也證實FIRS 新生兒心肌損傷發生率為27.87%,顯著高于非FIRS 組(5.26%)。

但是截至目前,FIRS 介導的心肌損傷具體分子機制,尚不明確。 Mitchell 等[13]通過構建靈長類宮內感染模型,來探求FIRS 患者所致心肌損傷的具體機制,結果顯示:通過PCR 技術共609 個分子探針來鑒別心臟組織中差異表達的分子,其中FIRS 組心臟組織中IL-6 和白細胞介素-8(interleukin-8, IL-8)顯著高于對照組。 此外,炎癥因子作為FIRS 重要的致病機制已經成為共識,IL-6 水平變化值已經成為重要的診斷依據[7,14-17]。 因此,炎癥因子IL-6的升高,可能是FIRS 導致心肌損傷的潛在病因。

但是IL-6 是直接導致FIRS 介導的心肌損傷,還是通過其他分子途徑進行調節,其機制尚不明確。 既往研究表明,炎性細胞因子IL-6 可在炎癥感染后發生結構改變,成為活化的前體物質并上調MMP-9 表達。 而MMP-9 可促進炎性細胞的趨化、聚集,加速血管內皮IV 型膠原纖維的降解,破壞臟器結構并加重炎癥損傷[18]。 本研究首先對FIRS 新生兒和對照組進行了IL-6、MMP-9 水平的檢測,結果顯示,FIRS 組中IL-6 和MMP-9 水平顯著增加。筆者基于此,進一步設計動物實驗,來探討IL-6 通過調節MMP-9 表達水平介導FIRS 所致心肌損傷的可能機制。

本研究通過羊膜囊注射LPS 來構建小鼠FIRS模型。 結果通過胎盤組織學檢測,來判定建模的成功率,本研究建模成功率為83.73%,和既往研究報道相仿[19-21]。 本研究中,FIRS 組心臟組織IL-6、MMP-9、TIMP-1 及M/T 比值顯著高于對照組,P＜0.05。 此外,人體內存在MMP-9 天然抑制劑TIMP-1,而結果顯示FIRS 組M/T 比值顯著高于對照組,這提示MMP-9 在心肌損傷的結局中起到了關鍵性作用。 而進一步的相關性分析結果顯示,IL-6 水平的表達和MMP-9、TIMP-1 及M/T 比值呈正相關,進一步驗證了IL-6 通過調節MMP-9 發揮FIRS 心肌損傷的機制。

維甲酸(RA)是維生素A 的代謝中間產物,是已經上市獲批腫瘤治療的藥物,研究表明RA 具有抑制MMP-9 表達的作用[22]。 Axel 等[23]研究表明RA 可顯著降低血管內皮細胞 MMP-9 的表達水平,可逆轉心血管疾病的進展。 此外,陽雙健等[24]研究發現維甲酸可下調MMP-9 的表達,并進一步增強滋養層細胞侵襲及促血管形成能力。 本研究通過應用RA 來干預FIRS 小鼠,結果顯示IL-6、MMP-9、TIMP-1 及M/T 比值相較于FIRS 組均有不同程度下降,P均＜0.05。 結果提示,RA 能減輕小鼠體內的炎癥反應,對炎癥所致的心肌損傷起保護作用,MMP-9 抑制劑相關的藥物有可能成為治療FIRS 早產兒心肌損傷的潛在藥物。

綜上所述:FIRS 可通過釋放IL-6,調節MMP-9、TIMP-1 水平及M/T 比值,介導早產兒心肌損傷的發生,應用MMP-9 抑制劑相關藥物可在心肌損傷過程中發揮保護作用,為臨床提供潛在治療藥物。