新冠肺炎寒濕疫小鼠模型的建立及其評價

朱淑敏寧為民董明國歐健釗黃海陽侯少貞高 潔*

(1.廣州中醫藥大學中藥學院,廣州 510006;2.東莞市中醫院,廣東 東莞 523000;3.東莞廣州中醫藥大學研究院, 廣東 東莞 523808)

在中醫理論中,新冠肺炎的病因屬于中醫“疫病”的范疇,具有發病急驟、癥狀相似、傳染性強、病情較重的特點[1]。 COVID-19 發病狀態與疫毒侵襲能力、地域環境,人群狀態密切相關。 有研究文章稱為“寒濕疫”,病位在肺、脾,可波及心、肝、腎[2]。嶺南是我國南方五嶺以南地區的概稱,受亞熱帶季風海洋性氣候影響,全年雨水豐富,空氣濕度高,具有溫暖、潮濕的特點[3]。 溫病學家葉天士提到“粵地潮濕,長夏涉水,外受之濕下起”,此描述體現了嶺南地區氣候潮濕的特點[4]。 根據中醫藥治療的思路,對于病毒導致的疾病,不針對其本身治療,而是先確定疾病的病因病機,然后進行辨證論治,重點關注機體整體狀態和機體免疫轉化調節方面[5]。故而對于新冠肺炎,建立符合嶺南地區特點的中醫藥理論的動物模型十分重要。 目前,關于新冠肺炎模型報道中醫科學院的模型,耿子涵等[6]將BALB/c 幼齡小鼠放置于寒濕環境的人工氣候箱中結合滴鼻感染hCoV-229E 的方法建立小鼠模型,此方法建造模型與新冠肺炎臨床表現有一致性。 本研究依據實驗平臺本身條件,考慮到實驗的普適性,簡化相關的操作,從更基礎的實驗造模方向模擬新冠肺炎導致的細胞因子風暴,以及根據中醫理論,增加寒濕刺激。

本研究基于中醫理論對嶺南地區新冠肺炎病因的認識,對小鼠采取注射脂多糖引起細胞因子風暴疊加寒濕刺激的造模方法,建立符合中醫病因的證候模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SPF 級KM 小鼠24 只,體重18～22 g,購于珠海百試通生物科技有限公司[SCXK(粵)2020-0051]。 自由攝水飲食,自然光照,在廣州中醫藥大學中藥學院動物房[SYXK(粵)2019-0202],室溫(23±2)℃,相對濕度(55±5)%的SPF 級環境中飼養。 本實驗通過廣州中醫藥大學倫理要求(ZYD-2021-126),符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,北京索萊寶科技有限公司,批號:325D031);ELISA 試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司:TNF-α(批號:202107),IFN-γ(批號:202107),IL-6(批號:202107),IL-10(批號:202108), PGE2 ( 批號: 202108); TRPV1 抗體(Affinity,批號:#66k4063);TRPA1 抗體(SAB,批號:20211019);COX-2 抗體(SAB,批號:2609)。 冷凍高速離心機(賽默飛世爾科技,批號:75002420);光學顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司,批號:CKC2000);1510 型全波長酶標儀(賽默飛世爾科技,批號:1510-01208)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

動物分籠適應性飼養4 d 后,脂多糖+寒濕刺激組在籠底鋪與籠底面積相當的冰袋制造寒濕刺激,進行溫度及濕度監測。 脂多糖+寒濕刺激組小鼠第5 天到第8 天,每天進行寒濕刺激造模,在8 h 內處于溫度為0℃～8℃,濕度為90%～55%的環境,其余時間處于正常飼養環境。 脂多糖組和脂多糖+寒濕刺激組于第5 天上午注射5 mg/kg 的脂多糖生理鹽水溶液,于第8 天下午2 點進行解剖。 取材前所有動物禁食12 h,禁水2 h。

1.3.2 標本留取

血清分裝后放置于-80℃,需要時取出進行測定。 肺組織一部分裝于組織固定液中固定,后石蠟包埋;一部分保存于液氮中。

1.3.3 炎癥因子檢測

稱量保存在液氮中的小鼠左肺組織50 mg 于離心管中,加800 μL PBS 后于勻漿機進行勻漿,取勻漿上清,按酶聯免疫吸附試劑盒說明書步驟測定勻漿中前列腺素E2(PGE2)水平、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ 干擾素(IFN-γ)的含量。

1.3.4 病理檢測及分析

將在4%多聚甲醛中固定后的小鼠肺組織用75%,90%,95%,100%的乙醇和二甲苯在室溫下進行脫水,并用組織包埋機進行包埋。 用切片機將蠟塊切為5 μm 的薄片放置于載玻片上,于烘箱中烘干。 用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)將石蠟切片染色后,于顯微鏡下觀察肺組織病理變化情況并拍照。

1.3.5 造模后小鼠相關行為表征評價

造模完成后,觀察第2、4、6、8 天各組小鼠的行為狀態和精神狀態,并進行評分,評分標準如表1。

表1 評分標準Table 1 Standard for evaluation

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 動物模型的行為表征觀察

小鼠的行為狀態、精神狀態觀察結果如圖1 所示。 結果發現,在造模第2 天,脂多糖+寒濕刺激組小鼠行為狀態較為活躍,精神狀態較為焦躁;造模第4 天,增加寒濕刺激小鼠行為狀態評分降低,精神狀態評分也相應降低;隨造模時間推移,相較于第4 天的情況,在造模第6 天時脂多糖+寒濕刺激組小鼠的行為狀態和精神狀態明顯下滑。 在造模第8 天,脂多糖組與脂多糖+寒濕刺激組小鼠行為狀態和精神狀態與正常組的水平差距極大。 總結以上結果,小鼠能夠表現出與中醫理論下寒濕證相似的行為表征,說明增加寒濕刺激造模相對成功。

圖1 各組小鼠第2、4、6、8 天的行為表征評分(±s,n=8)Figure 1 Evaluation of behavior scores at the 2nd,4th,6thand 8th day

2.2 各組小鼠臟器指數變化

由圖2 可知,與正常組比較,脂多糖組和脂多糖+寒濕刺激組肺濕干重比(W/D)、脾指數、胸腺指數均有明顯上升趨勢,且兩組間脾指數、胸腺指數具有顯著性差異(P＜0.05);與脂多糖組比較,脂多糖+寒濕刺激組的W/D 數值增加,說明寒濕刺激加重小鼠肺組織的損傷;與脂多糖組相比,脂多糖+寒濕刺激組的胸腺指數增加,脾指數下降,說明寒濕刺激加重小鼠免疫組織的損傷。

圖2 造模對小鼠臟器指數的影響(±s,n=8)Note. A, Weight and dry ratio (W/D) in lung. B, Changes in mice spleen weight. C, Changes in mice thymus weight. Compared with normal group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with LPS group, NSP＞0.05.Figure 2 Effect of modeling on organ index in mice

2.3 小鼠肺組織細胞因子水平變化

采用酶免吸附法對各組小鼠肺組織勻漿中細胞因子的水平變化情況進行檢測。 由圖3、4 可知,與正常組比較,脂多糖組和脂多糖+寒濕刺激組小鼠肺組織勻漿中TNF-α、IFN-γ、IL-6 升高,IL-10 降低。 與脂多糖組相比,增加寒濕刺激組小鼠肺組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6 水平均顯著升高,且TNF-α 的差異具有統計學意義(P＜0.01)。 IL-10 的水平呈下降趨勢,脂多糖+寒濕刺激組與脂多糖組相比有顯著性差異。 (P＜0.01)。

圖3 各組肺組織勻漿中TNF-α 和IFN-γ 的水平(±s,n=6)Note. Compared with normal group, *P ＜0.05, **P ＜0.01.Compared with LPS group, NSP＞0.05, ##P＜0.01.Figure 3 Levels of the TNF-α and IFN-γ in lung tissue

圖4 各組肺組織勻漿中IL-6 和IL-10 的水平(±s,n=6)Note. Compared with normal group, **P＜0.01. Compared with LPS group, NSP＞0.05, ##P＜0.01.Figure 4 Levels of the IL-6 and IL-10 in lung tissue

2.4 病理結果

小鼠肺組織病理結果顯示(圖5),正常組小鼠的肺組織結構完整,無滲出液,肺泡間隔正常;脂多糖組小鼠與正常組小鼠比較,發現肺組織結構出現紊亂的情況,且肺泡的間隔增厚,出現明顯的間質水腫和炎性浸潤的病理現象;而脂多糖+寒濕刺激組小鼠肺泡支架塌陷,肺組織結構更加紊亂,肺泡間隔增厚程度更加明顯,且肺組織間質水腫和炎性浸潤的現象比脂多糖組小鼠更加嚴重。

圖5 小鼠肺組織HE 染色情況Figure 5 HE staining of mice lung tissues

2.5 COX-2/PGE2 通路結果

如圖6 所示,與正常組相比,脂多糖組和脂多糖+寒濕刺激組肺組織中COX-2 蛋白表達上升,且寒濕刺激增加了COX-2 蛋白表達水平(P＜0.05)。 與正常組相比,脂多糖組和脂多糖+寒濕刺激組肺組織中PGE2 的水平上升,且加了寒濕刺激后,與脂多糖組相比,PGE2 的水平有顯著性差異(P＜0.05)。

圖6 各組小鼠肺組織中COX-2 蛋白表達情況和PGE2 水平Note. Compared with normal group, **P＜0.01. Compared with LPS group, #P＜0.05.Figure 6 COX-2 protein expression and PGE2 level in lung tissues of mice in each group

2.6 各組小鼠肺組織中TRPV1 和TRPA1 蛋白表達情況

與正常組相比,脂多糖組小鼠肺組織TRPV1 蛋白表達水平明顯下調;增加寒濕刺激后,與脂多糖組相比,TRPV1 蛋白表達水平明顯下調。 見圖7。與對照組比,脂多糖組和脂多糖+寒濕刺激組小鼠肺組織TRPA1 蛋白表達水平顯著上調(P＜0.05),且經寒濕刺激后,TRPA1 蛋白表達水平上升。

圖7 各組小鼠肺組織中TRPV1 和TRPA1 蛋白表達情況Note. A, Western blot strip of TRPV1. B, Protein expression of TRPV1. C, Western blot strip of TRPA1. D, Protein expression of TRPA1. Compared with normal group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with LPS group, NSP＞0.05.Figure 7 Protein expression of TRPV1 and TRPA1 in lung tissues of mice in each group

3 討論

在此次新冠肺炎的臨床治療中,嶺南地區在中醫藥使用上,表現出積極的療效,然而,大部分臨床使用處方缺乏動物實驗數據支持。 其中的主要原因是缺乏相應的動物模型。 而中醫藥治療病毒性肺炎的方式,重點在于根據疾病證候特點,從而進行辨證論治,在機體整體狀態調節上有更多關注[7-8]。 因此,構建符合中醫證候、適用于中醫藥藥效評價的動物模型極其重要。 相關研究表明,新冠肺炎與細胞因子風暴密切相關[9]。 故而在本研究中,采用脂多糖誘導小鼠產生細胞因子風暴及根據中醫理論增加寒濕刺激來模擬新冠肺炎的生理及病理變化。

本研究中,在中醫寒濕證表現方面,脂多糖+寒濕刺激模型小鼠從造模第 6 天開始,小鼠出現扎堆不動、蜷臥籠角、減少活動、精神狀態頹唐等這些表現均符合文獻報道中寒濕證動物模型的特征[10-11],且與臨床患者狀態相似[12]。

實驗結果表明,造模后,脂多糖+寒濕刺激組的W/D 值與正常組相比有統計學差異,說明小鼠的肺水腫比較嚴重。 對于脾指數和胸腺指數,因為胸腺和脾是重要的免疫器官,檢測其臟器指數可間接在一定程度上反映機體免疫功能的狀態。 實驗中脂多糖+寒濕刺激組小鼠脾指數和胸腺指數明顯高于正常組,可能是免疫功能紊亂,使胸腺、脾代償性增生。 與脂多糖組相比,脂多糖+寒濕刺激組的脾指數有下降趨勢,說明寒濕刺激可能會降低脾的免疫功能。

本實驗通過HE 染色直觀展現小鼠肺組織損傷情況,發現脂多糖組小鼠和脂多糖+寒濕刺激組小鼠肺組織明顯出現水腫、肺泡結構發生破壞、炎性細胞浸潤等病理學現象,這些病理學現象的改變與臨床中肺炎的病理學表現一致。 模型小鼠TNF-α、IFN-γ 和IL-6 顯著升高,與冠狀病毒感染的肺炎臨床表現一致[13-14]。

TNF-α、IL-6 等細胞因子可誘導COX-2 表達,導致PGE2 水平增高,PGE2 對肺泡細胞發揮細胞抑制和毒性效應[15]。 本研究發現寒濕刺激能夠明顯增加肺COX-2 蛋白表達水平,提示寒濕刺激可能通過激活COX-2/PGE2 通路的表達來加重肺損傷。

對于實驗數據中,脂多糖+寒濕刺激小鼠模型比脂多糖模型的炎癥更加嚴重,猜測與瞬時受體電位通道有關。 相關研究表明,TRPV1、TRPA1 屬于瞬時受體電位通道家族成員,TRPV1 可被辣椒素激活,也能被傷害性熱刺激(＞ 43℃)和低pH (pH ＜6. 0)活化,而TRPA1 主要參與18℃以下的損傷性冷感受,兩者在呼吸系統也有較為廣泛的表達[16-17]。 有研究發現,TRPV1 能通過夠降低CD11b的表達,從而降低大鼠肺組織中單核及中性粒細胞炎癥趨向性,抑制炎癥擴散[18]。

通過實驗數據,可以知道寒濕環境因素可能通過上調TRPA1 蛋白的表達水平來加重炎癥反應。此外,蛋白印跡法結果顯示,相比于脂多糖組,增加寒濕刺激后可下調TRPV1 蛋白表達,提示寒濕刺激可能通過抑制TRPV1 蛋白表達來加重小鼠的肺損傷。

本研究顯示,脂多糖+寒濕刺激模型小鼠能夠模擬新冠肺炎的臨床變化,包括外觀和行為表征、肺部病理學變化、肺部炎性細胞因子水平,為中醫理論下嶺南地區的新冠肺炎病證提供可能的動物模型。 且在瞬時受體電位方向為寒濕環境如何加重小鼠肺組織損傷提供淺顯的證明,具體的機制機理還需要更加深入的研究。