精氨酸加壓素1b 受體敲除對雌性大鼠焦慮和社交行為的影響

趙崟機樊 圃

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 醫學分子生物學國家重點實驗室,北京 100005)

精氨酸加壓素(arginine vasopressin,AVP),簡稱為加壓素,也稱為抗利尿激素。 加壓素主要在下丘腦室旁核和視上核中合成[1],經由神經垂體后葉釋放于血液中,通過作用于動脈血管和腎的AvpR1a和AvpR2 受體來調節動脈壓和水的再吸收。 同時精氨酸加壓素也會通過作用于垂體前葉的AvpR1b受體來促進促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing-hormone,CRH)和促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)的分泌以及通過激活位于腎上腺髓質的AvpR1b 受體釋放兒茶酚胺(catecholamine,CA),在應激和焦慮中發揮多重調節作用[2]。

研究表明,在哺乳類中樞神經系統中僅存在AvpR1a 和AvpR1b 受體,其中AvpR1b 受體不僅參與調控下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamicpituitary-adrenal axis,HPA)的活性[3],還通過調控其它腦區來影響嚙齒動物的焦慮水平及多種行為。如向基底外側杏仁核(basolateral amygdala,BLA)注射AvpR1b 受體拮抗劑之后,發現大鼠焦慮程度降低,向中央杏仁核(central amygdala,CEA) 注射AvpR1b 受體拮抗劑之后有抗抑郁的作用[4]。 此外AvpR1b 受體還調節社會行為,如AvpR1b 受體缺失導致攻擊性增強[5],并且AvpR1b 受體在控制情緒識別[6]、社會動機[7]、母嬰照顧[8]等方面都起到了重要作用。

研究表明,室旁核加壓素神經元缺失會使雄性小鼠焦慮水平升高,但不影響雌性小鼠的焦慮行為[9]。 研究表明,向側間隔(lateral septal nucleus,LS)腦區注射AVP,可增強幼年雄性大鼠的社會認知,但對雌性大鼠社會認知沒有影響[10]。 并且AVP調控攻擊行為具有性別特異性[11],提示AVP 在調節焦慮水平和社會行為方面存在性別差異。 大腦中的AVP 發揮功能依賴于AVP 在大腦中的受體,這暗示著精氨酸加壓素的受體在調節焦慮以及社會行為方面也可能存在著性別差異。 已有文獻報道在AvpR1a 受體敲除小鼠中焦慮水平存在性別差異[12],但AvpR1b 受體對焦慮水平的調控是否存在性別差異并無研究報道,以往研究多針對雄性中AvpR1b 受體敲除的對焦慮以及社會行為的影響,對于AvpR1b 受體敲除在雌性中對焦慮以及社會行為造成影響的研究較少。 一些精神疾病的發病率存在性別差異,例如女性被診斷出患有焦慮癥的頻率是男性的2.25 倍[13],關注雌性動物可能會解釋發病率中的性別差異,并提供針對不同性別的治療方法。 但目前多數研究缺乏對雌性動物的關注,因此,本研究采用雌性大鼠作為模式動物研究敲除AvpR1b 受體對雌性大鼠焦慮以及社會行為的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級10 周齡的AvpR1bKO雌性SD 大鼠和野生型雌性SD 大鼠各12 只,體重210～230 g。 SPF級SD 大鼠,購于北京維通利華[SCXK(京)2021-0006],使用CRISPR/Cas9 技術構建了AvpR1bKO的SD 大鼠,由北京大學饒毅實驗室惠贈。 后進行擴大繁殖,通過AvpR1b+/-雜合子交配得WT 和AvpR1bKO大鼠。 大鼠飼養和行為實驗均在中國軍事醫學研究院國家蛋白質科學中心SPF 級動物房[SYXK(軍)2020-0002]進行,飼養溫度為(25±2)℃,濕度控制在40%～60%,暗周期為中午12:00-24:00。 本實驗所有動物飼養和行為實驗均符合實驗動物“3R”原則,經由中國醫學科學院基礎醫學研究所動物倫理委員會批準(IACUC-A01-2021-048)。

1.2 主要試劑與儀器

Denharts(賽默飛,美國,批號:2191092);Yeast RNA(羅氏,美國,批號:50678421);Herring sperm DNA(賽默飛,美國,批號:2149750);DIG RNA Labeling Mix(羅氏,美國,批號:39354521);Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments(羅氏,美國,批號:32871922)。 Bond Elut Plexa 柱(安捷倫,美國,批號:6588422-02);冰凍切片機(徠卡,德國,型號:CM3050s);三重四極桿液質聯用系統(安捷倫,美國,型號:6495C);正置顯微鏡(徠卡,德國,型號:DM6B);曠場裝置(上海欣軟,中國,型號:XRXZ301);高架十字迷宮裝置(上海欣軟,中國,型號:XR-XG201)。

1.3 實驗方法

1.3.1AvpR1bKO大鼠鑒定

剪取出生第10 天左右的大鼠腳趾,進行加入蛋白酶K 進行裂解。 根據NCBI 中AvpR1b基因序列設計引物, 引物序列為: F:5’-CTCCTTTCATTG TCCTTTCCATC-3’;R:5’-CAGGTTCTTGTAGATCTC GTGGC-3’。 反應程序為:94℃預變性2 min,94℃變性30 s,60℃退火25 s ,72℃延伸60 s,進行35 個循環,72℃延伸10 min,4℃保存,擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.3.2 原位雜交

根據NCBI 中的AvpR1b基因序列設計并制備探針。AvpR1bKO和WT 大鼠各3 只,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)后進行心臟灌流,剝離腦組織。于4℃環境下利用多聚甲醛灌注液固定24 h,后利用蔗糖對組織進行梯度脫水。 取出脫水組織,用冷凍切片包埋劑包埋,進行冠狀切片。 貼片后將干燥的腦片在50℃烘箱中烘烤20～30 min。 加入4%多聚甲醛溶液,室溫放置20 min。 浸入磷酸緩沖鹽溶液中5 min。 加蛋白酶K 緩沖液,室溫放置10 min。浸入磷酸緩沖鹽溶液中5 s。 加4%多聚甲醛溶液,室溫放置10 min。 浸入磷酸緩沖鹽溶液中5 min。加入三乙胺緩沖液,室溫放置10 min。 浸入磷酸緩沖鹽溶液中5 min。 加入預雜交液,室溫放置1 h。加入制備好的探針,混勻后置于85℃金屬浴鍋中5 min,隨后立即放入冰水混合物中3 min,震蕩混勻后,將混合均勻的雜交液加入到載玻片,蓋上蓋玻片,置于65℃水浴鍋中孵育12～16 h。 劃掉蓋玻片,在65℃的緩沖液中浸泡60 min。 在室溫的緩沖溶液中分別浸泡5 min。 加入含有羊血清的緩沖液室溫放置1 h。 加入抗地高辛并攜帶堿性磷酸酯酶標記的探針,在濕盒中4℃孵育過夜。 在室溫的緩沖液中浸泡20 min。 腦片加入堿性磷酸酯酶顯色反應液,濕盒中孵育2 h。 后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗,停止反應后封片。 使用徠卡正置顯微鏡DM6B 顯微鏡的20 倍鏡頭拍攝。

1.3.3 高效液相色譜法測皮質酮含量

用皮質酮標準品制備10、20、30、40、50 ng/mL的標準品,進行標準曲線的繪制。 測試樣品為靜息狀態下AvpR1bKO和WT 雌性大鼠經尾靜脈取血得到的血清。 使用安捷倫公司Agilent Bond Elut Plexa 30 mg,1 mL 小柱進行樣品前處理。 處理后樣品使用高效液相色譜串聯高分辨質譜檢測血清中皮質酮含量。 測試參數為:C8色譜柱,柱溫為35℃,流動相A 為水+1%甲酸,流動相B 為甲醇+1%甲酸,流速為0.3 mL/min,液相梯度為:80%～0%A,20%～100%B,0～4 min;100%B,4～6 min;0%～80%A,100%～20%B,6～8 min。

1.3.4 曠場實驗

曠場測試箱尺寸為100 cm×100 cm×50 cm,將大鼠放入測試箱的中心區域,攝像機記錄其探索曠場過程5 min,利用Anymaze 軟件分析其進入中心區域的時間和次數。

1.3.5 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮由兩個開放臂、兩個閉合臂和中央平臺組成,將大鼠頭部正對開放臂放放入高架十字迷宮。 攝像記錄其5 min 內運動軌跡,利用Anymaze 軟件分析其進入開放臂區域的時間和次數。

1.3.6 位置偏好實驗

三箱實驗設備為100 cm×40 cm×30 cm,由一個中央室和左右兩個側室組成,大鼠可以通過中央室和側室的開口自由探索整個設備,在左右側室中各有一個空的束縛器,將大鼠放入中央室。 使大鼠自由地探索10 min,記錄并分析其進入左右側室的時間。 將大鼠進入左右側室的總時間作為分母,大鼠進入左側室的時間作為分子,計算位置偏好指數。

1.3.7 社交能力測試實驗

將大鼠放入中央室,此時一側室的束縛器中有一只同年齡同性別的陌生大鼠1,另一側室中的束縛器沒有大鼠。 使大鼠自由地探索10 min,記錄并分析其探索陌生大鼠和空束縛器的時間。 將大鼠探索空束縛器和陌生大鼠1 的總時間作為分母,將大鼠探索陌生大鼠1 的時間作為分子,計算社交能力指數。

1.3.8 社會新穎性測試實驗

將大鼠放入中央室,此時左右側室中其中一側室束縛器中是陌生大鼠1 保持不變,另一側室中的束縛器中有一只新的同年齡同性別的陌生大鼠2。使大鼠自由探索10 min,記錄并分析其探索陌生大鼠1 和陌生大鼠2 的時間。 將大鼠探索陌生大鼠2和陌生大鼠1 的總時間作為分母,將大鼠探索陌生大鼠2 的時間作為分子,計算社交新穎性指數。

1.4 統計學方法

本研究所得數據采用GraphPad Prism 8.0 進行統計分析并作圖,計量資料以平均數±標準差(±s)表示。 使用t檢驗進行組間數據比較,P＜0.05 表示具有顯著差異,P＜0.01 表示具有極顯著差異。

2 結果

2.1 AvpR1bKO 大鼠的鑒定

PCR 鑒定結果如圖1 所示,WT 大鼠PCR 產物大小為883 bp,而AvpR1bKO大鼠PCR 產物大小為786 bp,PCR 表明AvpR1bKO大鼠中AvpR1b基因第一外顯子中97 bp 序列被成功敲除。 利用探針對大鼠室旁核與視上核腦區的AvpR1b 受體進行原位雜交,結果如圖2 所示,AvpR1bKO雌性大鼠室旁核與視上核不表達AvpR1b 受體。

圖1 AvpR1bKO 大鼠的鑒定Note. M, DNA marker. 1, AvpR1bKO rats. 2, WT rats.Figure 1 Identification of AvpR1bKOrats

圖2 AvpR1b 基因敲除對大鼠室旁核和視上核精氨酸加壓素1b 受體表達的影響Figure 2 Effect of AvpR1b gene knockout on AvpR1b expression level in PVN and SON

2.2 AvpR1b 基因敲除對大鼠靜息狀態下皮質酮含量的影響

靜息狀態下的WT 大鼠和AvpR1bKO大鼠血漿中皮質酮含量如圖3 所示。 WT 雌性大鼠在靜息狀態下血漿皮質酮含量與AvpR1bKO雌性大鼠在靜息狀態下血漿皮質酮含量無顯著性差異(P＞0.05)。

圖3 AvpR1b 基因敲除對大鼠靜息狀態下皮質酮含量的影響Figure 3 Effect of AvpR1b gene knockout on basal corticosterone (CORT) content in rats

2.3 AvpR1b 基因敲除對大鼠焦慮水平的影響

在曠場實驗中,WT 大鼠和AvpR1bKO大鼠進入中心區域的時間和次數如圖4 所示。 與WT 雌性大鼠相比,AvpR1bKO大鼠探索中心區域的時間和次數無顯著性差異(P＞0.05)。

圖4 AvpR1b 基因敲除對大鼠探索曠場中心區域時間和次數的影響Figure 4 Effects of AvpR1b gene knockout on central zone exploring duration and entries in OFT in rats

在高架十字迷宮實驗中,WT 雌性大鼠和AvpR1bKO雌性大鼠進入開放臂區域的時間和次數如圖5 所示。 與WT 雌性大鼠相比,AvpR1bKO大鼠進入開放臂區域的次數無顯著性差異(P＞0.05),進入開放臂區域的時間也無統計學上的差異(P＞0.05)。

圖5 AvpR1b 基因敲除對大鼠探索高架十字迷宮開放臂時間和次數的影響Figure 5 Effects of AvpR1b gene knockout on open arm exploring duration and entries in EPM in rats

2.4 AvpR1b 基因敲除對大鼠社交能力的影響

在位置偏好實驗中,如圖6 所示,WT 大鼠和AvpR1bKO大鼠進入左室和右室的時間總和無顯著性差異(P＞0.05)。 同時,WT 和AvpR1bKO大鼠的位置偏好指數無顯著性差異(P＞0.05),證明AvpR1bKO大鼠具有正常的位置偏好。

圖6 AvpR1b 基因敲除對大鼠位置偏好的影響Figure 6 Effects of AvpR1b gene knockout on location preference in rats

在社會互動能力實驗中,如圖7 所示,WT 大鼠和AvpR1bKO大鼠探索空室和陌生大鼠1 的時間總和無顯著性差異(P＞0.05)。 同時,WT 大鼠和AvpR1bKO大鼠的社交能力指數無顯著性差異(P＞0.05),證明AvpR1bKO雌性大鼠具有正常的社交能力。

圖7 AvpR1b 基因敲除對大鼠社交能力的影響Figure 7 Effects of AvpR1b gene knockout on sociability in rats

2.5 AvpR1b 基因敲除對大鼠社會新穎性的影響

在社會新穎性的測試中,如圖8 所示,WT 大鼠和AvpR1bKO大鼠探索熟悉程度高的陌生大鼠1 和熟悉程度低的陌生大鼠2 的時間總和無差異(P＞0.05)。 同時WT 和AvpR1bKO雌性大鼠的社會新穎性指數無顯著性差異(P＞0.05),證明AvpR1bKO雌性大鼠的具有正常的社會新穎性。

圖8 AvpR1b 基因敲除對大鼠社會新穎性的影響Figure 8 Effects of AvpR1b gene knockout on social novelty in rats

3 討論

AvpR1b 受體在大腦中分布廣泛,研究表明AvpR1b 受體存在于室旁核、視上核以及海馬等區域[14]。 本研究利用原位雜交方法驗證了在WT 大鼠室旁核和視上核腦區存在AvpR1b 受體,而AvpR1bKO雌性大鼠的室旁核和視上核腦區不存在AvpR1b 受體,并且PCR 結果顯示AvpR1b第一外顯子97 bp 敲除成功。 因而AvpR1bKO鼠可用于研究AvpR1b的缺失對雌性大鼠靜息狀態下血漿中皮質酮含量、焦慮水平以及社交能力的影響。

下丘腦-垂體-腎上腺軸在維持基礎和應激狀態下的內環境平衡中起著重要作用。 在HPA 軸中,AvpR1b 受體表達于垂體前葉和腎上腺髓質,有調控激素釋放的作用。 本研究發現,在靜息狀態下WT 雌性大鼠與AvpR1bKO雌性大鼠血漿中的皮質酮含量沒有差異。 在雄鼠的研究中,WT 雄性小鼠與AvpR1bKO雄性小鼠在靜息狀態下的皮質酮含量也無顯著性差異[15],表明AvpR1b 受體的缺失不影響HPA 軸的基礎調節能力。 但在面臨長期壓力或有害刺激的情況下,AvpR1b 受體的缺失會損害HPA軸的反應,例如在強迫游泳以及束縛壓力后,AvpR1bKO雄性小鼠血漿中促腎上腺皮質激素水平較WT 雄性小鼠血漿中促腎上腺皮質激素水平顯著下降[16]。 提示著AvpR1b 受體在HPA 軸應對刺激中起到調控作用。

曠場與高架十字迷宮實驗可以測試動物焦慮水平,進入曠場中央區域和開放臂區域的時間和次數顯示焦慮程度,進入時間越長、次數越多表明焦慮程度越低。 在本實驗中,與WT 組相比,AvpR1bKO大鼠未表現出焦慮樣表型。 這與AvpR1bKO雄性小鼠焦慮水平不變的結論相符合[5,17]。 但在向雄性小鼠腹腔注射AvpR1b 受體拮抗劑會降低焦慮水平[18],轉基因大鼠和藥理學數據之間的差異可能由于轉基因大鼠AvpR1b 受體在其整個發育過程中的缺失,引起了代償作用。

三箱行為實驗中,嚙齒類動物通常花費更多時間去探索同類,而在陌生鼠和熟悉鼠之間,更偏向于選擇探索陌生大鼠[19]。 本實驗中AvpR1bKO和WT大鼠都具有正常的社交能力與社交新穎性。 符合雄性小鼠具有正常的社會互動性[20]和社交新穎性[5]的研究。 本實驗中AvpR1bKO大鼠在短期內能夠識別出與其進行互動過的鼠,證明AvpR1bKO大鼠短期社交記憶正常。 更多關于AvpR1b 受體的研究則聚焦于長期的社交記憶形成中,研究報道AvpR1bKO雄性小鼠的長期社交記憶受到了損傷[5],具體表現為AvpR1bKO雄性小鼠不能識別出30 min之前進行過社會互動的鼠。 特異性激活海馬AvpR1b 神經元延長了社交記憶的維持時間[21]。 這些研究結果提示,AvpR1b 受體在長期社交記憶形成中起到了重要作用,而對社交能力與社交新穎性無顯著影響。

綜上所述,AvpR1b基因敲除降低了AvpR1b 受體在室旁核與視上核的表達,不影響雌性大鼠的焦慮行為、社會互動能力與社交新穎性。

本研究測試了AvpR1bKO雌性大鼠基礎焦慮水平與社交水平,結果表明缺失AvpR1b基因并不影響這些行為,為深入研究AvpR1bKO雌性的社會記憶、攻擊行為、應激等復雜行為提供了參考依據。 本研究聚焦于靜息狀態下的焦慮與社交水平,而AvpR1b 受體還參與HPA 軸的動態活動的調控,并且HPA 軸在應激與壓力的調節中也起到重要作用[22]。 這提示AvpR1b 受體有可能參與應激、壓力、恐懼狀態下的行為調控。 所以本研究下一步要對應激、壓力狀態下AvpR1bKO大鼠進行行為研究,能幫助我們進一步理解AvpR1b 受體在調控嚙齒類動物行為中的作用。 本研究彌補了對AvpR1bKO大鼠基礎焦慮和社交行為研究中的雌性空缺,與AvpR1bKO雄性小鼠表現出類似的行為特征。 但大鼠與小鼠之間存在物種差異,為排除物種差異對行為的影響,后續需要測試AvpR1bKO雄性大鼠的基礎焦慮以及社交行為進行后,再對性別差異進行比較。