兩個(gè)CBA 亞系流產(chǎn)模型數(shù)據(jù)比較

王 蕾吳旭穎高玉龍張文明李 斌劉云波

(1.北京華阜康生物科技股份有限公司,北京 102202;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京 100021)

CBA 和DBA/2 是較常用的兩個(gè)小鼠近交品系。CBA(雌性)和DBA/2(雄性)交配組合具有易患反復(fù)自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)的特點(diǎn)。 近年來(lái)這一組為RSA 動(dòng)物模型,其重要價(jià)值在國(guó)際上正逐步引起重視,近些年在國(guó)內(nèi)逐漸引起關(guān)注[1],參考文獻(xiàn)報(bào)道CBA(雌性)和 DBA/2(雄性)交配胚胎吸收率21%～56%[2],各家文獻(xiàn)差異較大。

本公司有兩種CBA 品系,一種CBA/J,一種CBA/Ola。 CBA/J 小鼠是1920 年由Strong 用Bagg白化雌鼠與DBA 雄性鼠交配后進(jìn)行近交培育,1947年引到Andervont 處,1948 年引到JAX[3]。 CBA/Ola小鼠是1983 年從JAX 引到OLAC,1985 年由OLAC引到IMLAS[4]。 CBA/Ola 亞系雖然來(lái)源于CBA/J,但是通過(guò)長(zhǎng)期的選育形成不同的亞系。

本研究對(duì)CBA/J 和CBA/Ola 小鼠的自然流產(chǎn)模型造模情況進(jìn)行觀察比較。 自然流產(chǎn)是指胚胎或胎兒因某種原因自動(dòng)脫離母體,終止妊娠而排出。 胚胎吸收是由于小鼠子宮的特殊結(jié)構(gòu),由于某種原因胎兒停育,而不會(huì)出現(xiàn)出血和流產(chǎn),但是胎兒被母體吸收,卻不影響其他胚胎的妊娠。 根據(jù)小鼠這種特殊生理情況,研究小鼠自然流產(chǎn)模型造模情況主要觀察胚胎吸收率、胚胎吸收數(shù)量、胎盤(pán)直徑大小和體積等[5]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

流產(chǎn)模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF 級(jí),詳見(jiàn)表1,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK(京)2019-0008]。 實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在北京華阜康生物科技股份有限公司屏障環(huán)境(隔離器)內(nèi)[SYXK(京)2019-0022],隔離環(huán)境為潔凈度5 級(jí),溫度(24±2)℃,相對(duì)濕度(50±10)%,換氣次數(shù)為每小時(shí)20次,明暗周期為12 h:12 h,動(dòng)物自由采食和飲水,飼料為華阜康生產(chǎn)的60Co 輻照滅菌的鼠繁殖料1035。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(HFKIACUC-20190321),符合動(dòng)物倫理學(xué)要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)的相關(guān)規(guī)定,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中做到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則,并給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

表1 流產(chǎn)模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Table 1 Experimental animals of abortion model

飲用水為酸化過(guò)濾自來(lái)水(pH=2.7～3.0)并經(jīng)高壓蒸汽滅菌30 min(121℃)。 所用籠具、墊料、水瓶等物品均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌 30 min(132℃),每周更換墊料1 次,進(jìn)出隔離器的物品均應(yīng)進(jìn)行消毒處理,操作嚴(yán)格遵守隔離系統(tǒng)規(guī)程。

1.2 主要試劑與儀器

75%乙醇購(gòu)自山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司,批號(hào)20210101。

Canon 單反數(shù)碼相機(jī),型號(hào)EF-S 18-55 mmU;上匠游標(biāo)卡尺(0～150 mm),型號(hào)SJ455515,用于測(cè)量胎盤(pán)的直徑;手術(shù)器械,用于解剖懷孕14 d 小鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

為了研究?jī)蓚€(gè)CBA 亞系(CBA/J 和CBA/Ola)流產(chǎn)模型的造模情況,分別對(duì)2 個(gè)周齡(10 周和16周)雌鼠的造模情況進(jìn)行研究。 每個(gè)周齡又設(shè)計(jì)3組,分別為1 組:本品系互配組CBA♂×CBA♀;2組:流產(chǎn)模型對(duì)照組BALB/c♂×CBA♀;3 組:流產(chǎn)模型實(shí)驗(yàn)組DBA2♂×CBA♀。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

雌性CBA 小鼠飼養(yǎng)在雄鼠臟墊料中,2～3 d 后挑選發(fā)情的雌性小鼠按照上述分組合籠。 詳細(xì)操作為:實(shí)驗(yàn)當(dāng)天下午挑選發(fā)情的CBA/J 和CBA/Ola雌鼠,17:00 放入雄鼠的籠盒中,互配10～12 h 檢查陰道栓。 見(jiàn)栓為懷孕0.5 d。 繼續(xù)按照互配分組飼養(yǎng)13.5 d 后,進(jìn)行解剖、拍照、胎盤(pán)直徑測(cè)量。 對(duì)各組動(dòng)物見(jiàn)栓及懷孕、胚胎吸收情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對(duì)各組胎盤(pán)直徑進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)分析及胚胎吸收的判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。 數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組見(jiàn)栓、懷孕、胚胎吸收情況

由于挑選發(fā)情雌鼠時(shí)間跨度長(zhǎng)(本實(shí)驗(yàn)從2021年3 月24 日開(kāi)始,2021 年5 月20 日結(jié)束),所以10周組數(shù)據(jù)為9～15 周雌鼠數(shù)據(jù),16 周組數(shù)據(jù)為15～21 周雌鼠數(shù)據(jù)。 各組配動(dòng)物見(jiàn)栓及懷孕、胚胎吸收情況見(jiàn)表2。

表2 各組配動(dòng)物見(jiàn)栓及懷孕、胚胎吸收情況Table 2 Embolism, pregnancy and embryo absorption in each group of mice

2.2 各實(shí)驗(yàn)組胚胎直徑及體積數(shù)據(jù)分析

解剖觀察CBA/J 與CBA/Ola 各周齡雌鼠胚胎吸收外觀特征相似。 剖開(kāi)可見(jiàn)未完全吸收的胎盤(pán),胚胎已經(jīng)消失。 正常14 d 胚胎全部大小基本一致(長(zhǎng):0.8～1 cm;寬0.4～0.5 cm),但是胚胎長(zhǎng)和寬也會(huì)隨著胎兒數(shù)量的多少而稍微有些變化,觀察到如果胎兒數(shù)量多則胚胎偏小,數(shù)量少則胚胎偏大。

用游標(biāo)卡尺測(cè)量胎盤(pán)直徑,并做好記錄,用組間單因素方差分析檢驗(yàn)對(duì)各組胎盤(pán)的直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)分析,各組之間比較,10 周CBA/Ola 2組胎盤(pán)直徑顯著長(zhǎng)于10 周CBA/Ola 1 組和3 組(P＜0.05);16 周CBA/Ola 2 組胎盤(pán)直徑顯著長(zhǎng)于16周CBA/Ola 1 組和3 組(P＜0.05)。 其余組間未見(jiàn)顯著差異(見(jiàn)表3)。 有報(bào)道胎盤(pán)體積=πd3/6,小于同孕齡胎鼠胎盤(pán)單位平均體積減去 2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差者判為體積明顯縮小,判定為胚胎丟失[5]。 按照上述公式計(jì)算出胎盤(pán)體積(見(jiàn)表3)。

表3 各組正常胎盤(pán)直徑及體積數(shù)據(jù)Table 3 Nomal placenta diameter and volume datas of each group

通過(guò)胎盤(pán)體積計(jì)算和統(tǒng)計(jì),10 周CBA/J 3 組顯著高于本組其他兩組(P＜0.05),10 周CBA/Ola 2 組顯著高于本組其他兩組(P＜0.05),16 周CBA/Ola 2 組顯著高于本組其他兩組(P＜0.05)(見(jiàn)表3)。 有報(bào)道指出新生兒出生體重正常者較低體重者,其胎盤(pán)體積較大[6]。 胎盤(pán)體積可能與胎兒數(shù)量及體重有關(guān)。

對(duì)吸收胎盤(pán)的直徑進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,只有16 周CBA/J 3 組胚胎吸收胎盤(pán)直徑顯著高于本組其他組(P＜0.05),其他各組間差異不顯著(見(jiàn)表4)。 對(duì)胚胎吸收胎盤(pán)平均體積進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,只有16 周CBA/J 3 組胚胎吸收胎盤(pán)體積顯著高于本組其他組(P＜0.05)。

表4 各組胚胎吸收胎盤(pán)直徑及胎盤(pán)體積數(shù)據(jù)Table 4 Absorbed placenta diameter and volume datas of each group

從表4 數(shù)據(jù)可以看出,參考文獻(xiàn)[5]中的判斷方法可取。 但是發(fā)現(xiàn)10 周CBA/Ola1 組胚胎吸收胎盤(pán)直徑數(shù)據(jù)計(jì)算的胎盤(pán)體積按照文獻(xiàn)判斷方法,體積大于平均值減去兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,本品系互配發(fā)現(xiàn)的胚胎吸收情況,原因可能與CBA 品系的背景基因有關(guān),還需要進(jìn)一步研究。

3 討論

與雄性DBA/2 小鼠(H-2d)交配后的雌性CBA 小鼠(H-2k)的流產(chǎn)率高達(dá)20%～30%,而且這種流產(chǎn)具有隱性、反復(fù)性和父系特異性的特征;在同為H-2k×H-2d 交配方式的CBA×BALB/c 中,孕鼠的胚胎吸收率僅為5%～10%。 這個(gè)發(fā)現(xiàn)為深入研究妊娠這一復(fù)雜生理現(xiàn)象提供了兩個(gè)經(jīng)典的動(dòng)物模型[1]。

大多關(guān)于自然流產(chǎn)模型的一般認(rèn)為母胎界面的免疫異常導(dǎo)致的[7-13]。 而且通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),CBA/J 雌鼠比CBA/Ola 雌鼠造模率高。 CBA/J 16周雌鼠比CBA/J 10 周雌鼠造模率高,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。 此外有報(bào)道指出環(huán)境越潔凈,造模率越高[15]。 造模第一胎流產(chǎn)率小,第二胎流產(chǎn)率增加[2]。 但是一般實(shí)驗(yàn)很少用二胎來(lái)進(jìn)行。

還有報(bào)道指出DBA2 存在天然的Klrd1(CD94)缺失,筆者認(rèn)為與流產(chǎn)模型的造模機(jī)理有一定的關(guān)系[14]。

本研究進(jìn)一步探討兩個(gè)CBA 兩個(gè)亞系流產(chǎn)模型數(shù)據(jù)比較,流產(chǎn)模型的造模機(jī)理較復(fù)雜,還需要進(jìn)一步研究,本文為科學(xué)研究提供快速建模的數(shù)據(jù)支持。