兩種幽門螺桿菌檢測方法的臨床比較

譚翠 王楠方 呂國恩

529500江門市中心醫院窺鏡中心，廣東江門

幽門螺桿菌(HP)是微需氧菌，革蘭染色陰性。HP 的感染流行率與年齡、地區、種族和社會經濟狀況相關[1]。HP感染與消化系統相關疾病密切相關，故第五次全國HP 感染處理共識提出，凡是HP 陽性患者均需要進行HP 根除治療[2]。檢測患者是否有HP 感染對患者的治療有指導意義。目前臨床上有多種針對HP 檢測的方法，不同檢測方法的特異性也有所差異，目前診斷HP感染的檢測方法分為侵入性同非侵入性兩大類，常見侵入性方法有病理組織法、胃黏膜組織聚合酶鏈反應(qPCR)、細菌培養、細菌涂片等；非侵入方法有血清抗體檢測、胃液快速尿素酶法、13C、14C呼氣試驗；研究表明，HP 感染數周后方可在血中發現特異抗體，因此血清抗體檢測HP 陰性不能作為除外感染，在HP 根除后血清中抗體仍可維持＞6 個月，血清抗體檢測HP 陽性不能作為現癥感染的證據[3]。有文獻報告，在13C尿素呼氣試驗中，少量的HP可能使呼出13CO2達不到閾值而產生假陰性結果，與快速尿素酶法一樣，其檢查結果亦受患者服用抗生素以及抑酸劑的影響[4]。另外，非侵入性檢測方法亦不能對患者胃黏膜病變程度以及治療效果作出有效評估，因此，侵入性胃鏡檢查對于診斷HP 感染仍有必要。本文以組織病理學檢測法為“金標準”，對胃黏膜組織的qPCR 檢測侵入性方法與非侵入性快速尿素酶檢測兩種方法進行對比分析，檢測其各自敏感性與特異性，評價兩者應用價值。

資料與方法

選取2020年5-9月因上腹部不適在江門市中心醫院進行胃鏡檢查的患者92 例，男44 例，女48 例；年齡23～78歲，平均50.19歲；慢性胃炎63例，十二指腸球炎11 例，膽汁反流性胃炎5 例，消化性潰瘍11例，胃癌術后2例。

納入標準：①所有患者均因上腹部不適而行胃鏡檢查；②近4 周內未服用抗生素、抑酸劑等影響HP檢測結果的藥物；③無HP 根除治療史，無胃腸部手術史；④患者均已經簽署知情同意書。

排除標準：①心肺功能差，不能耐受胃鏡檢查；②合并幽門梗阻、上消化道出血等影響HP 檢測結果的疾病；③心、肝、腎嚴重疾病者；④治療不配合者。

方法：患者檢查當天空腹10 h 由同一醫生行胃鏡檢查，于胃竇部取小塊胃黏膜組織用于檢查。胃黏膜組織qPCR 法：通過美國國家生物技術信息中心GenBank數據庫數據，以胃幽門螺桿菌ureC基因作為HP 檢測靶標，以人類看家基因ACTB 作為熒光檢測的內對照，分別設計特異性引物、探針，由生物公司合成。胃黏膜組織通過組織DNA 提取試劑盒提取DNA，并置于-80℃冰箱保存。在熒光擴增反應中，每個樣本均做3 個重復，每管20 μL 反應體系包括10 μL 2×GoldStar Probe Mixture，10 μM引物HP-F、HPR、ACTB-F、ACTB-R 各0.5 μL，10 μm 探針HP-P、ACTB-P 各1 μL，2 μL核酸模板及適量的水。配好反應液置于ABI 7500 熒光定量PCR 儀(ThermoFisher)中進行擴增，設置擴增條件95℃，15 s；56℃，30 s；65℃，40 s并收集熒光，擴增40個循環。引物探針序列，見表1。

表1 物探針序列

胃黏膜組織病理檢測法：胃鏡下鉗取胃竇部組織，于10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋切片，HE 染色，染色結果由2 位病理醫生同時閱片作出病理診斷。快速尿素酶法：取胃液樣本2滴加入離心管中，將蓋蓋緊，振搖30 s，并靜置2 min，使溶液和蓋上的酚紅試紙接觸，接觸后與色卡對比觀察結果，一般在3 min 內出現顏色變化，試紙由黃色變成紅/紫紅色，即為陽性，顏色未變為陰性。

觀察項目：根據提取的數據，導出2×2 個應急表，以確定敏感性、特異性。所有統計數據都以其95%置信區間(95%CI)作為絕對值報告。靈敏度和特異性分別根據公式TP(真陽性)/TP+FN(假陰性)和TN(真陰性)/TN+FP(假陽性)計算。

統計學方法：采用SPSS 18.0 統計學分析系統展開數據處理；計數資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

不同檢測方法的陽性率比較：以組織病理HP 結果作為診斷金標準，qPCR 的陽性率與組織病理學檢查比較，差異無統計學意義(P＞0.05)；尿素酶試驗的陽性率高于組織病理學檢查和qPCR，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同檢測方法的陽性率比較[n(%)]

不同檢測方法的檢出結果比較：92 例患者中，組織病理學檢查的陽性例數為14，陰性例數為78。qPCR 檢查的陽性例數為16，陰性例數為76。尿素酶試驗檢查的陽性例數為59，陰性例數為33。

不同檢測方法的敏感性與特異性比較：qPCR 的敏感性與尿素酶試驗比較，差異無統計學意義(P＞0.05)；qPCR 的特異性高于尿素酶試驗，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 不同檢測方法的敏感性與特異性比較[n(%)]

討論

HP 是一種常見的胃上皮細胞感染，與胃、十二指腸酸性消化性疾病、胃腫瘤及胃腸道以外的疾病也相關。流行病學調查顯示，全世界人群HP 的感染率在59.2%左右，其中有癥狀的在15%～20%[5]。HP 在全世界各個年齡段的人群中均有發現，HP 的治療非常必要，而準確診斷HP 是治療HP 感染的關鍵。本研究以組織病理學檢測結果作為“金標準”，用快速尿素酶檢測與qPCR 分子檢測兩種方法對比，研究結果顯示，qPCR 檢測法的敏感性與特異性均優于快速尿素酶檢測法。

快速尿素酶檢測法是通過檢測HP 產生的尿素酶將尿素分解成氨和二氧化碳，其中氨可使周圍介質pH值升高，使試劑變色，取胃液標本檢測，具有簡單、快速、無創、便宜的優點。但應用質子泵抑制劑、抗生素和鉍劑進行治療后可能導致假陰性結果[6]。胃內存在其他產脲酶細菌，如頭孢葡萄球菌也可能導致假陽性結果。

PCR用于細菌檢測，還可用于廣譜感染檢測、新發感染評估、細菌基因型鑒定、抗生素耐藥性和流行病學研究，PCR反應成功的關鍵是準確的引物設計和正確的基因選擇[7-8]。本研究用ureC 基因作為HP 檢測靶標，ureC 可用于擴增HP 基因組，≥2 個的靶基因擴增以提高HP 的特異性，從而使HP 的診斷減少假陽性；以人類看家基因ACTB 作為熒光檢測的內對照，分別設計特異性引物、探針，由生物公司合成。qPCR 檢測方法不依賴于形態識別，所以不會因質子泵抑制劑、鉍劑、抗生素等藥物導致假陰性，不存在個體偏倚，可快速、準確、高效、自動化檢測HP。

qPCR 和尿素酶試驗的敏感性相當，均能有效檢出HP 感染，但qPCR 檢測法的特異性高于快速尿素酶檢測法，并且qPCR 檢測法不受藥物影響，保證了胃腸道疾病中抗生素及抑酸劑等藥物的應用。