新型四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇衍生物的合成及對Cdc25B抑制活性評價

楊 娜, 魯 源, 張曉暉*

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院 藥劑部,內蒙古 呼和浩特 010050； 2.內蒙古醫科大學 藥學院,內蒙古 呼和浩特 010059)

隨著人口老齡化、居民生活壓力增加以及環境污染等因素,惡性腫瘤的發病率和死亡率逐年上升,已成為當前社會最具破壞性的疾病之一,嚴重威脅著人類的健康和生命[1-2]。細胞分裂周期25B磷酸酶(Cdc25B)是細胞分裂周期的關鍵調控因子,具有促進細胞有絲分裂的作用[3]。研究證明,Cdc25B在食管癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多種人類癌癥中過度表達,Cdc25B已成為一個治療癌癥的重要靶點[4-6]。

研究發現,大量雜環化合物通過抑制Cdc25B的活性而起到抗腫瘤的作用[7-10]。嘧啶衍生物是一類重要的雜環化合物,具有重要的化學和藥理學意義,其本身具有殺菌、除草、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化等多種生物活性,其中,抗癌活性在醫藥領域得到了廣泛關注和研究[11-13]。近年來,本課題組一直致力于雜環類抗腫瘤藥物的研究與合成,期望可以篩選出較好的Cdc25B抑制劑[14-20]。

本文以5-氨基四唑和丙二酸二乙酯為原料,合成了四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1)和一系列新型四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇衍生物(2a～2m),這些化合物均未見文獻報道。其結構經1H NMR,13C NMR, IR, ESI-MS和元素分析等表征。合成路線如圖所示(Scheme 1)。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XT-4A型雙目顯微熔點測定儀(溫度未經校正)；UV-100型分光光度計；Bruker AV-500 MHz型核磁共振波譜儀(TMS為內標,DMSO為溶劑)；Nicolet Impact 410型紅外光譜儀(KBr壓片)；Finnigan Lcq Advantage Max型液-質聯用儀；PE-2400型元素分析儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1)的合成

將1 g的5-氨基四唑與5.6 mL的丙二酸二乙酯置于反應瓶中,于150 ℃下加熱攪拌2 h。用50%乙醇溶液稀釋反應混合物,析出大量固體產物,過濾,乙醚洗滌(3×10 mL)。用DMF/乙醇重結晶,得黃色晶體1.21 g,產率81%, m.p.298～300 ℃;1H NMRδ: 12.14(1H, OH/NH), 11.21(1H, OH), 3.95(s, 1H, C=C—H); IRν: 3312(—OH), 3127(—NH—), 1691(C=O) cm-1; ESI-MSm/z: 153{[M+H]+}; Anal. Calcd for C4H3N5O2: C 31.38, H 1.98, N 45.74, found C 31.40, H 1.95, N 45.71。

(2) 6-苯基偶氮四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇(2a～2m)的合成

將取代苯胺1.5 mmol和水2 mL加入反應瓶,冰水浴下滴加濃鹽酸4 mL,析出白色固體。將亞硝酸鈉0.10 g(1.5 mmol)溶于8 mL水中,緩慢滴加到上述體系中,0～5℃攪拌1 h,得到取代苯胺的重氮鹽溶液,備用。

將0.23 g(1.5 mmol)化合物1溶解于AlCl3溶液(0.5 gAlCl3溶于60 mL水)中,在0～5 ℃下滴加取代苯胺的重氮鹽溶液,滴畢,于室溫攪拌過夜。所得固體經抽濾,冷水洗滌,干燥,DMF/水重結晶得到目標產物2a～2m。

2a: 橘色晶體0.32 g,產率85%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.15(1H, hydrazoNH), 11.19(1H, OH), 8.27～7.52(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.23, 155.98, 152.08, 149.66, 142.04, 130.08, 128.15, 124.56, 123.71, 119.92; IRν: 3365(—OH), 3144(—NH—), 3087(ArH), 1682(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6ClN7O2: C 41.18, H 2.07, Cl 12.16, N 33.62, found C 41.16, H 2.09, Cl 12.19, N 38.63。

2b: 橘色晶體0.36 g,產率81%, m.p.320 ℃;1H NMRδ: 12.03(1H, hydrazoNH), 11.32(1H, OH), 8.12～7.37(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.26, 155.99, 152.08, 150.17, 141.87, 133.98, 130.21, 122.95, 119.33, 117.59; IRν: 3412(—OH), 3155(—NH—), 3042(ArH), 1667(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6ClN7O2: C 41.18, H 2.07, Cl 12.16, N 33.62, found C 41.20, H 2.06, Cl 12.13, N 33.60。

2c: 棕色晶體0.40 g,產率88%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.19(1H, hydrazoNH), 11.21(1H, OH), 8.33～7.69(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.22, 155.95, 152.08, 147.75, 142.01, 130.02, 128.16, 119.94; IRν: 3317(—OH), 3169(—NH—), 3077(ArH), 1680(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6ClN7O2: C 41.18, H 2.07, Cl 12.16, N 33.62, found C 41.21, H 2.04, Cl 12.17, N 38.65。

2d: 橘色晶體0.43 g,產率90%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.14(1H, hydrazoNH), 11.34(1H, OH), 8.23～7.69(m, 4H, ArH), 3.68(s, 3H,o-OCH3);13C NMRδ: 162.74, 156.03, 152.07, 145.87, 141.99, 136.65, 123.77, 123.53, 119.96, 117.08, 51.49; IRν: 3322(—OH), 3187(—NH—), 3078(ArH), 2889(AliphH), 1681(C=O), 1110(C—O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O3: C 46.00, H 3.16, N 34.13, found C 46.02, H 3.13, N 34.15。

2e: 棕色晶體0.41 g,產率91%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.32(1H, hydrazoNH), 11.14(1H, OH), 8.25～7.61(m, 4H, ArH), 3.78(s, 3H,m-OCH3);13C NMRδ: 162.53, 160.08, 156.01, 152.07, 150.15, 141.67, 130.78, 113.66, 112.17, 108.47, 51.96; IRν: 3237(—OH), 3160(—NH—), 3076(ArH), 2864(AliphH), 1693(C=O), 1120(C—O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O3: C 46.00, H 3.16, N 34.13, found C 45.99, H 3.18, N 34.16。

2f: 黑色晶體0.34 g,產率88%, m.p.315 ℃;1H NMRδ: 12.23(1H, hydrazoNH), 11.17(1H, OH), 8.17～7.28(m, 4H, ArH), 3.57(s, 3H,p-OCH3);13C NMRδ: 162.89, 155.99, 153.07, 152.07, 144.71, 141.85, 120.03, 119.18, 51.63; IRν: 3268(—OH), 3155(—NH—), 3079(ArH), 2863(AliphH), 1685(C=O), 1121(C—O) cm-1; Anal.calcd for C11H9N7O3: C 46.00, H 3.16, N 34.13, found C 46.02, H 3.15, N 34.11。

2g: 黑色晶體0.43 g,產率90%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.28(1H, hydrazoNH), 11.14(1H, OH), 8.23～7.34(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.52, 156.01, 152.08, 145.21, 141.96, 138.76, 135.45, 124.38, 123.59, 119.93; IRν: 3298(—OH), 3151(—NH—), 3114(ArH), 1693(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6N8O4: C 39.74, H 2.00, N 37.08, found C 39.76, H 2.02, N 37.05。

2h: 黑色晶體0.43 g,產率83%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.18(1H, hydrazoNH), 11.14(1H, OH), 8.15～7.41(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.55, 156.03, 152.08, 150.13, 149.37, 142.02, 130.78, 124.86, 117.99, 114.76; IRν: 3310(—OH), 3125(—NH—), 3098(ArH), 1695(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6N8O4: C 39.74, H 2.00, N 37.08, found C 39.77, H 1.98, N 37.07。

2i: 棕色晶體0.49 g,產率93%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.29(1H, hydrazoNH), 11.16(1H, OH), 8.21～7.64(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.62, 156.03, 153.35, 152.08, 142.31, 142.03, 125.28, 119.94; IRν: 3299(—OH), 3129(—NH—), 3081(ArH), 1689(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6N8O4: C 39.74, H 2.00, N 37.08, found C 39.71, H 2.03, N 37.06。

2j: 棕色晶體0.33 g,產率69%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.15(1H, hydrazoNH), 11.15(1H, OH), 8.15～7.51(m, 4H, ArH), 2.52(s,3H,o-CH3);13C NMRδ: 162.33, 155.99, 152.08, 149.55, 142.04, 130.18, 128.56, 127.74, 122.93, 119.07, 22.58; IRν: 3389(—OH), 3167(—NH—), 3077(ArH), 2918(AliphH), 1689(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O2: C 48.71, H 3.34, N 36.15, found C 48.73, H 3.31, N 36.12。

2k: 黑色晶體0.34 g,產率68%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.25(1H, hydrazoNH), 11.13(1H, OH), 8.21～7.32(m, 4H, ArH), 2.29(s, 3H,m-CH3);13C NMRδ: 162.27, 155.97, 152.08, 149.31, 142.01, 137.18, 129.98, 123.37, 119.48, 117.09, 22.87; IRν: 3278(—OH), 3139(—NH—), 3087(ArH), 2875(AliphH), 1682(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O2: C 48.71, H 3.34, N 36.15, found C 48.68, H 3.36, N 36.17。

2l: 橘色晶體0.33 g,產率69%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.17(1H, hydrazoNH), 11.12(1H, OH), 8.15～7.31(m, 4H, ArH), 2.41(s, 3H,p-CH3);13C NMRδ: 162.21, 155.92, 152.07, 148.12, 141.88, 131.22, 130.25, 119.23, 22.74; IRν: 3305(—OH), 3145(—NH—), 3097(ArH), 2962(AliphH), 1696(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O2: C 48.71, H 3.34, N 36.15, found C 48.72, H 3.35, N 36.16。

2m: 棕色晶體0.38 g,產率84%, m.p.>310 ℃;1H NMRδ: 12.22(1H, hydrazoNH), 11.35(1H, OH), 8.17～7.22(m, 5H, ArH);13C NMRδ: 162.44, 155.43, 152.08, 149.35, 141.57, 129.88, 122.87, 119.16; IRν: 3345(—OH), 3148(—NH—), 3066(ArH), 1686(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H7N7O2: C 46.70, H 2.74, N 38.12, found C 46.73, H 2.77, N 38.10。

2 結果與討論

2.1 反應條件的選擇

據文獻報道,用5-氨基吡唑,5-氨基-s-三唑與丙二酸二乙酯在乙醇鈉溶液中反應可得到吡唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇和s-三唑[2,3-a]并嘧啶-5,7-二醇[18-19]。但在本實驗中,用5-氨基四唑和丙二酸二乙酯在相同條件下未成功合成四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇,而5-氨基四唑與過量的丙二酸二乙酯在150 ℃加熱2 h,得到了四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1)。

在衍生物2a～2m的合成中,我們首先以衍生物2d的制備為模型反應,利用TLC對反應條件進行優化。在以AlCl3為催化劑,pH值為5.0的酸性條件下,在0～5 ℃的冰水浴中,取代苯胺的重氮鹽溶液與化合物1發生了非均相偶聯,呈現出有色的2d。在不含AlCl3的水溶液中,不能形成偶氮嘧啶或偶氮嘧啶不顯色,說明AlCl3作為催化劑,由于其發生水解可提高反應介質的酸度。

2.2 譜學數據分析

化合物1的IR顯示,在3127 cm-1處(N—H)、 3312 cm-1處(O—H)、 1691cm-1處(C=O)均有較強的吸收峰。化合物1的1H NMR顯示,δ12.14(1H, OH或NH)處有一個單峰,δ11.21(1H, OH)處有一個單峰,δ3.95(s, 1H, C=C—H)處有一個單峰。

目標化合物2a～2m可能以兩種互變異構體形式存在,即以偶氮烯醇(A)和偶氮酮(B)的形式存在(Chart 1)。所有目標化合物的IR在3183～3125 cm-1處(N—H)、 3213-3425 cm-1處(O—H)、 1692～1662 cm-1處(C=O)有強吸收峰。各目標化合物氫的數量和化學位移也都可以在1H NMR中找到其相應的數據。2j,2k,2l分別在δ2.52, 2.29, 2.41(o-CH3,m-CH3,p-CH3)處有一個單峰。2d,2e,2f分別在δ3.68, 3.78, 3.57(o-OCH3,m-OCH3,p-OCH3)處有一個單峰。

Chart 1

化合物2a～2m在δ8.33～7.09(Ar—H)處有多重峰；在δ11.45～10.70(1H, OH),δ12.32～12.03(1H, hydrazoNH)處有單峰。通過光譜數據分析得知,目標化合物因其在固態和DMSO中以分子內氫鍵保持穩定而以結構B的形式存在。

2.3 目標化合物對Cdc25B的抑制活性

采用熒光底物OMFP,經Cdc25B去磷酸化后得到的產物OMF在被485 nm激發光激發后可發射出波長為535 nm的可檢測的熒光信號,從而觀察酶的活性變化以及化合物對其的抑制情況。實驗中Cdc25B所采用的陽性參照化合物為Na3VO4,經初步篩選,選擇的純化合物濃度為20 μg·mL-1,而對于抑制率大于50%的樣品,繼續測試其活性劑量的依賴關系。通過樣品活性對樣品濃度進行非線性擬和,通過軟件Graphpad Prism 4計算得到IC50值(酶活性被抑制50%時藥物的濃度)。此部分工作由國家新藥篩選中心協助完成,結果如表1所示。

表1 目標化合物2a～2m對Cdc25B的抑制活性

由表1實驗結果可知,化合物2b,2c,2h,2i和2m對Cdc25B有良好的抑制活性,抑制率分別為84.57%, 79.36%, 95.35%, 96.97%和97.66%, IC50值為(0.94±0.04)～(2.18±0.11) μg·mL-1。目標化合物的活性均低于陽性對照物Na3VO4。通過對目標化合物活性結果分析發現,在苯環無取代基或在苯環間位和對位引入吸電子基時活性增強。

本文合成了新的嘧啶衍生物四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1),并在含AlCl3的水中制備了一系列新的苯基偶氮四唑并嘧啶(2a～2m)。研究了苯基偶氮四唑并嘧啶(2a～2m)的結構表征及生物活性。這些衍生物的吸收光譜結果表明,結構B是其存在形式。此外,通過國家新藥篩選中心進行的藥理活性篩選結果發現,化合物2b,2c,2h,2i和2m對Cdc25B有較高的抑制率,其中化合物2m對Cdc25B的抑制活性最高,IC50值為(0.94±0.04) μg·mL-1,為新型Cdc25B抑制劑的篩選提供了參考。