海蜇dmrta2基因的克隆及其在橫裂生殖中的表達分析

葛建龍, 陳曉輝, 陳四清, 劉長琳, 陳昱辰, 邊 力, 張盛農

海蜇基因的克隆及其在橫裂生殖中的表達分析

葛建龍1, 陳曉輝1, 陳四清1, 劉長琳1, 陳昱辰2, 邊 力1, 張盛農1

(1. 中國水產科學研究院 黃海水產研究所, 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266071; 2. 鹽城市華億水產有限公司, 江蘇 鹽城 224300)

基因家族在后生動物性別決定與分化以及組織和器官的形成等發育過程中發揮著重要作用。為探究家族基因在海蜇()橫裂生殖中的功能, 本研究以海蜇轉錄組測序獲得的基因片段為基礎, 通過RACE技術獲得了海蜇基因的cDNA全長, 并分析了其在橫裂生殖不同時期的表達模式。結果顯示海蜇基因cDNA全長為1 804 bp, 開放閱讀框為1 011 bp, 所編碼蛋白質含336個氨基酸, 分子質量為37.25 kDa, 理論等電點為9.11。預測海蜇編碼蛋白為親水性蛋白質, 無跨膜區域, 不含信號肽。在33至79位氨基酸之間具有基因家族保守的DM結構域, 與珊瑚、果蠅等物種的同源基因相應區域高度一致。系統進化分析顯示, 海蜇DMRTA2與鹿角珊瑚DMRTA2和DMRT3以及海葵DMRTA2的親緣關系最近。原位雜交顯示基因在海蜇橫裂生殖后期主要表達于感覺緣葉原基位置, 在初生碟狀體中表達于感覺棍位置。研究結果表明,基因參與海蜇橫裂生殖過程, 可能主要與感覺棍神經系統的分化發育相關, 研究為進一步解析海蜇等缽水母橫裂生殖的分子調控機制提供了基礎數據。

海蜇; 橫裂生殖;; 表達模式

(double-sex and mab-3 relatated transc-ri-p-tion factor) 是指與果蠅基因和線蟲基因同源的一類轉錄調控因子, 主要特征是所編碼的多肽鏈中包含保守的鋅指樣DNA結合基序—DM結構域[1]。目前, 除海綿動物外所有后生動物中均報道了基因的存在[2], 而不同物種中基因的種類不盡相同[1], 功能涉及性別決定與分化、組織和器官的形成以及相關功能的維持等多方面[3]。

海蜇()主要分布于西北太平洋, 其生長迅速、膠質層厚實, 深受消費者喜愛, 是我國重要的增養殖品種, 同時是我國開展缽水母研究的代表種類[4]。海蜇具有世代交替的生活史, 包括營棲息生活的無性階段(即缽口幼體或水螅體)和營浮游生活的有性階段(即水母體)[4]。在這樣的生命周期中, 從水螅體轉變為水母體是通過一個有序變態的過程實現的, 即“橫裂生殖”。橫裂生殖是海蜇等缽水母特有的一種無性繁殖方式, 首先, 橫向收縮將水螅體從近口端向遠口端依次分割為裂節, 其次, 兩個收縮之間的裂節部分經過變態發育成碟狀體, 隨后, 它們與水螅體母體脫離開始其浮游生活, 并在幾周內生長為幼水母[5]。隨著一次橫裂生殖的完成, 一些水螅體可以再生一個新的口柄和觸手, 并恢復他們以前的生活方式[5]。生活史各環節中, 橫裂生殖是缽水母從水螅體向水母體轉變的重要階段, 是影響水母體種群數量的重要環節。

橫裂生殖作為缽水母特有的無性生殖方式, 其顯著地變態發育過程一直吸引著國內外學者的關注[6-7]。我們先前的研究發現家族基因等11個轉錄調控因子可能與海蜇橫裂生殖相關[8], 與該研究結果相似, 在海月水母()中也鑒定了一個可能與橫裂生殖相關的家族基因[9], 然而家族基因在缽水母橫裂生殖中的具體作用尚無研究報道。因此, 本研究基于轉錄組測序獲得的海蜇基因的部分序列, 通過RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術獲得了該基因的全長序列, 并分析了其在海蜇橫裂生殖過程的表達模式, 旨在為闡明海蜇橫裂生殖分子調控機制提供一定基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海蜇螅狀體來自江蘇省鹽城市金洋水產良種場, 運回實驗室暫養于光照培養箱中, 螅狀體為當年繁育獲得。采用升溫法(培育水溫按2 ℃/d, 由10 ℃升高至18 ℃)誘導其橫裂生殖, 分別獲取螅狀體、橫裂初期、橫裂后期和碟狀體時期的樣品, 用于RNA提取的樣品浸入液氮速凍后保存于–80 ℃超低溫冰箱。

1.2 總RNA提取以及基因全長的克隆

采用Trizol法提取各樣品總RNA, 具體步驟參照Trizol試劑(Invitrogen)使用說明書。RNA質量及濃度分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測合格后, 利用Prime Script? RT reagent Kit試劑盒(TaKaRa), 反轉錄獲得cDNA第一鏈。

首先, 以先前轉錄組測序中獲得的一段同源序列為核心序列, 據此設計核心片段擴增引物(表1), 通過PCR擴增和Sanger測序確認核心序列。然后, 以確認后的核心序列為模板分別設計5′RACE和3′RACE的特異性引物, 按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)操作說明擴增基因5′末端和3′末端。PCR產物經切膠回收目的片段, 連接至 pMD19-T 載體后轉入E. coli DH5α細胞中, LB液體培養基培養后均勻涂布于LA(含氨芐青霉素)固體平板, 挑取陽性克隆樣品送至上海生工生物公司測序。最后, 利用SeqMan將核心片段及5′RACE和3′RACE片段的測序結果進行拼接, 獲得cDNA序列全長。

表1 基因克隆及表達分析所用引物序列

1.3 生物信息學分析

利用 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html)分析基因ORF并推導氨基酸序列; BlastP (http://blast.ncbi.nih.gov/)預測氨基酸序列的保守結構域及同源序列檢索; ClusterX2將海蜇與其他物種相應的氨基酸序列進行多重序列比對分析; Mega 7 構建N-J系統進化樹; SignalP 5.1(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分別預測是否具有信號肽和跨膜結構域; ProtParam(https:// web.expasy.org/protparam/)和Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的理化性質及蛋白質的疏水性; PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/ form2.html)預測蛋白亞細胞定位。

1.4 RT-PCR定量分析

根據基因全長序列設計實時定量PCR引物(表1), 以為內參基因, 以cDNA為模板, 采用SYBR Green試劑盒(Takara), 在ABI StepOneTM Plus 熒光定量PCR儀上進行定量PCR分析。反應體系如下: 2×Green PCR Master Mix 5 μL、引物(10 μmol/L)各0.2 μL和cDNA模板1 μL, 加PCR水至10 μL。擴增程序: 95 ℃、10 s; 95 ℃、15 s, 60 ℃、60 s, 40個循環, 每個循環最后一步時采集熒光信號。每個時期樣品設3個生物學重復和技術重復, 相對定量的結果采用2–ΔΔCt法進行計算, 實驗數據在Excel中進行數據分析和圖表繪制, 運用 SPSS 16.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析。

1.5 整體原位雜交

用于整體原位雜交的樣品, 先在2%烏來糖中(海水配置)麻醉10 min, 然后用新鮮配制的4%多聚甲醛-海水固定20 min, 按25%、50%、75%、100%梯度替換為4%多聚甲醛-PBS, 每次10 min, 4 ℃固定過夜, 最后, 按25%、50%、75%、100%梯度替換為100%甲醇, –20 ℃保存。

采用體外轉錄法制備地高辛標記RNA探針, 方法參考T7/SP6轉錄試劑盒(Invitrogen)說明書。首先, 設計正義和反義探針引物(表1), 并分別在正向引物或者反向引物5′端加T7啟動子序列, 進行PCR擴增, 產物經純化后作為探針合成的模板, 純化試劑盒為Takara。其次, 采用上述純化后的模板, 進行RNA體外轉錄合成, 反應體系: 10×transcription buffer 2 μL、10 mmol/L ATP 1 μL、10 mmol/L CTP 1 μL、10 mmol/L、GTP 1μL、10 m mmol/L UTP 0.6 μL, 3.5 mmol/L UTP- 11-DIG 1 μL, RNA polymerase mix (T7/SP6) 2 μL, 模板DNA 11.4 μL, 輕彈混勻離心后, 37 ℃水浴1.5 h; 反應完成后, 加入1 μL DNase I, 于37 ℃水浴20 min, 以去除殘留的DNA模板。最后, 轉錄反應產物經Mega RNA純化試劑盒回收純化, 取1μL探針進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, Nanodrop 2000測定探針濃度, –80 ℃保存備用。

整體原位雜交方法參照先前報道的方法[9], 略有改動。其中, 蛋白酶K處理濃度為10 g/L, 處理時間20 min。雜交液: 50% Formamid, 5x SSC, 0, 1% Tween- 20, 0, 1% CHAPS, 1x Denhardt’s solution, 100 μg/mL Heparin, (t-RNA 20 μg/mL, 現用現加)。采用地高辛檢測試劑盒的NBT/BCIP顯色, 每5 min解剖鏡下觀察一次, PBST漂洗10 min停止染色, 70%乙醇浸洗3次, 每次10 min, 最后替換為70%甘油, 4℃冰箱保存并于解剖鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 海蜇dmrta2基因的序列特征

海蜇基因的cDNA全長為1 804 bp, 包含169 bp的3′端與624 bp的5′端UTR, 開放閱讀框(ORF)為1 011 bp, 編碼336個氨基酸(圖1)。海蜇基因序列已上傳NCBI數據庫, Genbank登錄號為MT878494。經與參考基因組(http://gigadb.org/ dataset/view/id/100720/File_page/2)比對分析發現, 海蜇位于Scaffold SWAQ01000558.1, 含有3個外顯子和2個內含子。Protein blast顯示, 海蜇DMRTA2蛋白擁有DM和CUE兩個特征結構域, 分別位于第33～79和231～271位氨基酸。

通過在線軟件預測了DMRTA2蛋白的理化性質, 結果顯示其分子量為37 252.23 Da, 帶負電荷的氨基酸殘基數(Asp+Glu)為36個, 帶正電荷氨基酸殘基數(Arg+Lys)為48個, 理論等電點(pI)為9.11, 偏堿性。預測不穩定系數為52.3, 表明其編碼蛋白理化性質不穩定, 摩爾消光系數為25 285, 理論半衰期30 h, 脂溶系數為 61.52, 平均親水系數(GRAVY)為–0.649, 表明該基因編碼蛋白屬于親水性蛋白。組成海蜇DMRTA2蛋白的20種氨基酸中, 絲氨酸(Ser)最多, 所占比例為11.6%, 色氨酸(Trp)最少, 所占比例為0.6%。TMHMM Server v.2.0 分析顯示其無跨膜結構, Signal 5.1 分析顯示其不具有信號肽, 表明該分子為非分泌性蛋白, 蛋白亞細胞定位預測顯示其分布在細胞核的可能性最高, 為73.9%。

2.2 氨基酸序列比對和系統進化分析

從NCBI參考序列數據庫中下載代表性物種的DMRT家族蛋白序列進行多序列比對, 結果顯示海蜇DMRTA2蛋白的DM結構域序列與其他物種DMRTA2、DMRT5和DMRT99B序列相似性很高, 含有DM結構域最為保守的CCHHCCCC基序, 形成鋅指結構位點(CCHC的Site I和HCCC的Site II), 與之相比CUE結構域保守性較差, 而結構域之外的序列變異程度很高(圖2)。

本研究基于7個物種22個DMRT蛋白的DM結構域構建了系統進化樹, 結果顯示海蜇DMRTA2與鹿角珊瑚DMRTA2、鹿角珊瑚DMRT3以及海葵DMRTA2的親緣關系最近, 其次與線蟲MAB-3、線蟲DMD-4和果蠅DMRT93B聚為一支, 親緣關系較近, 與智人DMRT5、非洲爪蟾DMRT5以及果蠅DMRT99B的親緣關系最遠。特別的是海葵DMRTA1和DMRT3單獨聚為一支, 與海蜇DMRTA2等腔腸動物DMRT蛋白的親緣關系較遠(圖3)。

圖1 海蜇dmrta2基因的核苷酸序列與推測的氨基酸序列

注: 起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)采用紅色標記; polyA尾巴用藍色標記

2.3 海蜇dmrta2基因的表達模式

熒光定量PCR結果顯示, 相對于螅狀體時期,基因在橫裂生殖初期和碟狀體時期有顯著上調表達, 在橫裂生殖后期表達量最高, 顯著高于其他各時期(圖4)。整體原位雜交顯示,在螅狀體中基本無表達信號, 橫裂生殖初期的觸手基部有明顯表達, 橫裂生殖后期顯著表達于感覺緣葉原基部位, 碟狀體時期主要表達于感覺棍相應區域, 此外, 橫裂生殖后期以及碟狀體時期在口唇位置有一定表達(圖5)。

3 討論

腔腸動物是已知最原始的具有家族基因的后生動物[3], 因此對于基因家族起源與進化的研究有著重要意義, 目前僅在少量的腔腸動物中有基因的研究報道, 如鹿角珊瑚[10]、石珊瑚()[11]、海葵[12]和櫛水母()[13]。本研究克隆了缽水母綱腔腸動物的一個家族基因—海蜇基因, 獲得了該基因的cDNA全長序列, 通過NCBI序列比對發現該基因推導的氨基酸序列具有DM結構域, 屬于基因家族。序列分析發現海蜇基因的DM結構域包含保守的6個半胱氨酸(C)和2個組氨酸(H)序列, 能夠形成與Zn離子結合的兩個位點(CCHC和HCCC), 說明海蜇基因功能結構完整。序列比對也顯示了海蜇符合基因家族的序列特點, 即氨基酸全長序列差異很大, 可觀測到的同源性僅限于與DNA結合的DM結構域[14]。

圖2 海蜇DMRTA2與同源蛋白的序列比對

注: 黑色背景表示完全一致的氨基酸; 粉色背景表示相似性大于75%; 淺藍色背景表示相似性大于50%; 黃色背景表示相似性大于33%; 紅色下劃線指示保守的DM結構域, 藍色下劃線指示CUE結構域; 保守的鋅指結構用棕色框線(Site I)和綠色框線(Site II)指示; 非洲爪蟾(: NP_001089148.1); 智人(,: AAI36283.1); 秀麗隱桿線蟲(,: NP_495138.2); 果蠅(,: NP_524549.1); 海葵(,: XP_032231562.1); 鹿角珊瑚(: XP_029187503.1)

基于DM結構域的系統進化分析結果與已有研究報道基本一致, 如脊椎動物和、果蠅以及線蟲可能起源于共同的基因, 果蠅與脊椎動物是直系同源基因[2], 本研究中這些基因也相應地先聚為一個分支。本研究中海蜇與鹿角珊瑚、鹿角珊瑚以及海葵的親緣關系最近, 其次與線蟲、線蟲和果蠅聚為一支, 符合傳統的系統進化關系, 然而系統進化樹中海葵和單獨聚為一支, 與海蜇等腔腸動物基因的親緣關系較遠, 與傳統的系統進化關系不符, 一個可能原因是家族基因較短的DM結構域(約70個氨基酸)使系統進化關系的解析變得困難[2], 同時說明了家族基因在低等腔腸動物中的系統進化關系較為復雜, 有待進一步研究分析。

最初, 在果蠅和線蟲中發現了含有DM結構域的基因與性別決定相關[15-16], 而后越來越多的研究發現家族基因幾乎在所有動物發育的性腺組織中有特異性表達, 如珊瑚[10]、貝類[17-18]、甲殼類[19-20]、魚類[21]、爬行類[22]、鳥類[23]和哺乳類[24], 說明了家族基因與性別決定和性腺發育的密切相關。而除了在性腺中表達外, 一些研究中發現家族成員表達于神經組織, 參與神經系統和感覺器官的分化發育。例如, 在雞和小鼠中,表達于前腦、脊髓和嗅板中[25]; 在斑馬魚中,基因能夠調控神經分化基因的表達, 參與體節形成時端腦神經細胞的分化[26]; 爪蟾和共同表達于發育中的嗅葉, 是爪蟾嗅覺系統神經形成的重要轉錄調控因子[27-28]; 海葵可能是同源基因, 它能夠誘導爪蟾的神經形成, 而且敲降處理的海葵胚胎中神經元細胞明顯減少[28]。已有研究表明橫裂生殖過程中一個顯著的變化是逐步發育的碟狀體感覺棍神經系統(rhopadial nervous system)[29], 本研究中,基因在海蜇橫裂生殖后期主要表達于感覺緣葉原基位置, 在初生碟狀體中明顯表達于感覺棍位置, 因此, 海蜇橫裂生殖中基因的上調表達應該與感覺棍神經系統的分化發育相關。

圖3 DMRT家族蛋白的系統進化分析

注: 鹿角珊瑚(: XP_029187503.1,: XP_029183089.1); 海葵(,: XP_032232660.1,: XP_032231562.1,: XP_001628137.2); 秀麗隱桿線蟲(,: NP_001022464.1,: NP_510466.1,: NP_495138.2); 果蠅(,: NP_524428.1,: NP_524549.1,: NP_511146.2,: NP_731197.1); 非洲爪蟾 (,: NP_001089969.1,: NP_001089725.1,: NP_001084923.1,: NP_001089148.1), 智人(,: AAR89619.1,: NP_006548.1,: NP_067063.1,: NP_071443.2,: AAI36283.1)

圖4 Dmrta2在海蜇橫裂生殖過程的相對表達量

注: 在螅狀體時期的相對表達量設為1, 其他時期的表達量均以螅狀體表達量的倍數表示; 不同字母表示各組數據之間存在顯著性差異(<0.01)

圖5 Dmrta2在海蜇橫裂生殖過程的整體原位表達

注: A.螅狀體時期; B. 橫裂生殖初期; C. 橫裂生殖后期; D. 碟狀體時期; E. 碟狀體局部e的放大; bc. 體柱; bd. 基盤; gc. 消化腔管; mn. 口唇;. 感覺緣葉原基;. 碟狀體原;. 感覺緣葉;. 感覺棍;. 橫向裂節;. 觸手; 藍色為表達陽性信號

4 結語

綜上所述, 本研究成功克隆了海蜇基因的cDNA全長序列, 利用生物學分析軟件對其編碼蛋白的理化性質和系統進化關系等進行了分析, 通過原位雜交研究了其在橫裂生殖中的表達模式, 根據本研究原位表達結果以及已報道的同源基因的主要功能, 我們推測該基因在海蜇橫裂生殖中主要與感覺棍神經系統的分化發育相關, 研究結果為海蜇等缽水母橫裂生殖調控機制的解析提供了基礎數據。

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Cloning offrom jellyfishand its expression analysis during strobilation

GE Jian-long1, CHEN Xiao-hui1, CHEN Si-qing1, LIU Chang-lin1, CHEN Yu-chen2, BIAN Li1, ZHANG Sheng-nong1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Process, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China; 2. Huayi aquatic breeding limited company, Yancheng 224300, China)

Thegene family plays an important role in various developmental processes of metazoans, such as sex determination and differentiation and the formation of tissues and organs. Strobilation is a unique asexual reproductive mode of scyphozoan jellyfish and a key stage in the transformation from polyp to medusa. However, the understanding of molecular mechanisms under drastic metamorphosis is still limited. In a previous study, it was preliminary found that thegene family may play a crucial role in the strobilation of the jellyfish (); therefore, this finding is of great interest and needs further validation. In the present study, based on afragment from the RNA-sequence of, full-length complementary DNA (cDNA) ofwas obtained using the rapid amplification of cDNA ends (RACE) method, and its expression patterns during strobilation were studied. The results showed that the full-length cDNA ofwas 1804 bp, including an open reading frame (ORF) of 1011 bp length, which encodes 336 amino acids. The complete sequence ofhas been submitted to the GenBank database with the following accession number: MT878494. The molecular weight (MW) and theoretical isoelectric point (PI) were predicted to be 37.25 kDa and 9.11, respectively. It was a hydrophilic protein comprising nontransmembrane structure and signal peptides.ofhad a conserved DM-domain ofgene family between the 33rdand 79thamino acid, which exhibits a great similarity to the homology protein in coral, fruit fly, and so on. Phylogenetic analysis showed thatofwas closely related to the,of coralandof sea anemone. The whole-mounthybridizations showed thatlacked expression signal in the polyp stage, whereas it was expressed in the tentacle base of the early strobila stage, expressed distinctly in the pre-rhopalar lappets of late strobila and in the rhopalium region of ephyra. The results indicated thatwas involved in the strobilation ofand probably related to the differentiation and development of the rhopalium nervous system. To the best of our knowledge, all these results may provide important references for future studies of molecular regulation mechanisms of scyphozoan strobilation.

; strobilation;;expression pattern

Mar. 8, 2021

[Key Program for International S&T Cooperation Projects of China, No. 2017YFE0111100-5; National Natural Science Foundation of China, No. 31702327; Fund of Key Laboratory of Sustainable Develop-ment of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China, No. 20603022019020]

Q78

A

1000-3096(2022)06-0042-09

10.11759/hykx20210308002

2021-03-08;

2021-07-20

政府間國際科技創新合作重點專項(2017YFE0111100-5); 國家自然科學基金項目(31702327); 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室開放課題(20603022019020)

葛建龍(1988—), 男, 山東泰安人, 副研究員, 博士, 主要從事水產動物繁殖生物學研究, E-mail: gejl@ysfri.ac.cn; 陳四清(1966—),通信作者, 研究員, 研究方向: 水產動物繁育及增養殖技術, E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

(本文編輯: 康亦兼)