根際細菌LK2-3 對黃瓜枯萎病的生物防治作用

張婉菊，謝太震，陳夢多，王藝茹，沈虎生，何夢菡，樸鳳植，申順善

（1.河南農業大學植物保護學院 鄭州 450002； 2.河南農業大學園藝學院 鄭州 450002）

黃瓜枯萎病是由無性態真菌尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（f. sp.）引起的一種毀滅性土傳病害，在黃瓜整個生育期均能產生危害，在露地和保護地栽培中均可發生，尤其是在黃瓜連作地發生更為嚴重。目前，黃瓜枯萎病的防治以化學防治為主，但使用化學農藥容易產生抗藥性而導致防效降低，且化學農藥易殘留，容易引起環境污染和人畜安全等問題。植物病害的生物防治具有安全、無毒、環保等特點，彌補了植物病害傳統防治方法的缺陷，在農業生產上具有十分廣闊的應用前景，尤其在蔬菜病害防治方面優勢顯著。目前，利用生防細菌防治黃瓜枯萎病的研究比較活躍，已報道的黃瓜枯萎病生防細菌主要有解淀粉芽孢桿菌（）、枯草芽孢桿菌（）、蠟樣芽孢桿菌（）等芽孢桿菌屬和銅綠假單胞菌（）、熒光假單胞菌（）、弗雷德里克斯堡假單胞菌（）等假單胞菌屬。如，解淀粉芽孢桿菌（.）SF1103 和枯草芽孢桿菌（.）SF1104 對黃瓜枯萎病菌具有較強的拮抗能力，能有效防治黃瓜枯萎病，同時對黃瓜的生長有促進作用；蠟樣芽孢桿菌（.）Y3F 能分泌抑制病原菌生長的活性物質，顯著降低黃瓜根際土壤真菌和尖孢鐮孢菌數量；銅綠假單胞桿菌（.）BA5 對黃瓜枯萎病菌菌絲抑制率達58.33%，能有效防治黃瓜枯萎病；熒光假單胞桿菌（.）對黃瓜枯萎病菌菌絲抑制率達87.04%，降低了黃瓜枯萎病發病率；弗雷德里克斯堡假單胞菌（.）33-1 對黃瓜枯萎病具有很好的防治效果，防效達86.95%，同時對黃瓜具有促生作用。

目前，在生產上應用于黃瓜枯萎病生物防治的高效生防菌株還是有限。筆者從番茄根系分離篩選出生防細菌LK2-3，研究其對黃瓜枯萎病菌的抑制效果，確認其對黃瓜枯萎病的防治效果、對黃瓜的促生效果及其根際定殖能力，并對其進行鑒定，為黃瓜枯萎病的生物防治提供生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株LK2-3 為2020 年分離自河南省駐馬店采集的健康番茄根系，采用逐步提高誘導濃度的方法獲得穩定抗利福平（100 μL·mL）的菌株，保存于-80 ℃超低溫冰箱；黃瓜枯萎病菌尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（.f. sp.）由河南農業大學植物保護學院植物病害生物防治研究室提供；供試黃瓜品種為寒育6 號，是河南豫藝種業科技發展有限公司選育的抗枯萎病品種；供試培養基為TSA 培養基（TSB 30 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL）、PDA 培養基（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL）、PDB 培養基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL）和PDK 培養基（PDB 20 g，蛋白胨10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL）。

1.2 方法

試驗于2021 年1—12 月在河南農業大學植物保護學院植物病害生物防治研究室進行。

1.2.1 LK2-3 菌懸液的配制 將LK2-3 在TSA 培養基上培養72 h 后，用0.1 mol·LMgSO溶液配制成10cfu·mL的LK2-3 菌懸液。

1.2.2 尖孢鐮孢菌孢子懸浮液的配制 將在PDA培養基上培養的尖孢鐮孢菌菌餅接種到PDB 培養基，在恒溫搖床（28 ℃，160 r·min）培養5 d，然后用無菌水稀釋配制成1×10孢子·mL的孢子懸浮液。

1.2.3 LK2-3對黃瓜枯萎病菌的抑制活性測定 采用平板對峙法測定LK2-3 對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制效果。將尖孢鐮孢菌菌餅放在PDK 培養基平板中央，在距離菌餅25 mm 處接種LK2-3，置于28 ℃培養箱中培養5 d 后調查抑菌帶大小。采用懸滴法測定LK2-3 對黃瓜枯萎病菌孢子萌發的抑制活性。取等量的LK2-3 菌懸浮液（10cfu·mL）和尖孢鐮孢菌分生孢子懸浮液混合均勻，取20 μL 滴到凹玻片上，置28 ℃恒溫培養箱里保濕培養，每隔2 h 在顯微鏡下觀察分生孢子萌發情況，每次共觀察3 個視野，每個視野大概100個分生孢子，以無菌水和尖孢鐮孢菌分生孢子懸浮液混合作對照。

孢子萌發率/%= 萌發孢子數/調查孢子總數×100；

孢子萌發抑制率/%=（對照萌發率-處理萌發率）/對照萌發率×100。

1.2.4 LK2-3的防病效果和促生效果測定 采用盆栽試驗測定LK2-3 對黃瓜枯萎病的防治效果和對黃瓜的促生效果。試驗設4 個處理，即清水處理（CK）、LK2-3 處理、枯萎病菌處理（FOC）、枯萎病菌和LK2-3 處理（FOC+LK2-3），隨機區組設計，每處理3 次重復，每個重復15 株。將2 片真葉的黃瓜苗移栽至花盆（直徑9 cm），用LK2-3 菌懸液（10cfu·mL）進行灌注處理（100 mL·株），然后沿花盆邊緣灌注接種黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液（10 mL·株），在育苗室培育15 d 后，按照分級標準調查枯萎病發病程度，并計算病情指數和防治效果。同時，測定黃瓜株高、莖粗、葉鮮質量、葉干質量、根鮮質量、根干質量等黃瓜生育指標。調查黃瓜枯萎病分級標準：0 級為植株正常生長，不發病；1 級為植株有≤1/4 的葉片萎蔫；2 級為植株有＞1/4、≤2/4 的葉片萎蔫；3 級為植株有＞2/4、≤3/4的葉片萎蔫；4 級為植株萎蔫死亡。

病情指數=∑（各級病株數×各級代表值）/（調查總株數×最高級代表值）×100；

防治效果/%=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100。

1.2.5 LK2-3的根際定殖密度測定 采用稀釋涂布平板法測定LK2-3 的根際定殖密度，用LK2-3 菌懸液（10cfu·mL）進行灌根處理（100 mL·株）15 d 后測定LK2-3 在黃瓜根系和根際土壤的定殖密度。測定根系的定殖密度：輕輕拔出黃瓜根系，用流水沖洗干凈，吸干根表面的水分，稱取1 g 根系，研磨后用0.1 mol·LMgSO溶液稀釋一定濃度涂抹在添加利福平的TSA 培養基平板上，置于28 ℃恒溫箱培養48 h，待形成菌落，檢測菌落數并推算出在黃瓜根系的LK2-3 定殖密度；測定根際土壤中的定殖密度：取1 g 根際土壤，用0.1 mol·LMgSO溶液稀釋一定濃度涂抹在添加利福平的TSA 培養基平板上，培養同上，待形成菌落，檢測其定殖密度。

1.2.6 LK2-3的鑒定 LK2-3 菌株的形態特征及生理生化特性主要參考《伯杰氏細菌學鑒定手冊》，按照常規細菌學方法進行鑒定。將LK2-3 菌株在TSA 培養基上劃線培養72 h 后，觀察單菌落的形態、顏色、大小、透明度、光澤及邊緣特征等。采用革蘭氏染色法觀察LK2-3 菌體形態。

16S rRNA 序列同源性分析：將LK2-3 在TSA培養基上培養2 d，挑取細菌單菌落提取RNA，采用通 用 引 物27 f（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3’）和 1492 r（5’- TACGGHTACCTTACGACTT-3’）進行PCR 擴增，PCR 擴增采用50 μL反應體系（DNA：1 μL，Primer：各1 μL，Mix：25 μL，ddHO：22 μL），PCR 反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個循環后72 ℃延伸10 min。PCR 產物送生物公司測序，測序結果利用NCBI BLAST進行序列分析，并采用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

1.3 數據分析

采用Excel 2003 和SPSS 26.0 軟件進行數據分析，以最小顯著差數法（LSD）分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 LK2-3對黃瓜枯萎病菌的抑制活性

平板對峙試驗結果顯示，LK2-3 在PDK 培養基上對尖孢鐮孢菌形成明顯的抑菌帶，其直徑為0.55 cm（圖1）。黃瓜枯萎病菌孢子萌發試驗結果表明，在無菌水中培養2 h 時分生孢子萌發率為37.50%，培養8 h 時萌發率達到81.13%，而LK2-3處理的分生孢子培養2 h 時萌發率為16.63%，培養8 h 時萌發率為41.67%，培養8 h 時對分生孢子萌發抑制率達48.64%（圖2）。說明LK2-3 菌株對尖孢鐮孢菌的菌絲生長和孢子萌發均具有明顯抑制效果。

圖1 LK2-3 對尖孢鐮孢菌菌絲生長的抑制效果

圖2 LK2-3 對尖孢鐮孢菌孢子萌發的影響

2.2 LK2-3對黃瓜枯萎病的防治效果

盆栽試驗結果表明，黃瓜接種枯萎病菌后植株生長明顯受到抑制，處理10 d 時開始表現萎蔫癥狀，到15 d 時病情指數達到50.00，而LK2-3 處理的黃瓜15 d 時生長仍然良好，枯萎病病情指數僅為5.56，LK2-3 處理對黃瓜枯萎病具有顯著的防治效果，防治效果達到88.89%（表1）。由圖3 也可明顯看出，處理15 d 時LK2-3 對黃瓜枯萎病具有明顯的防治效果。

圖3 LK2-3 處理15 d 對黃瓜枯萎病的防治效果

表1 LK2-3 處理對黃瓜枯萎病的防治效果

2.3 LK2-3對黃瓜的促生效果

盆栽試驗結果顯示，LK2-3 處理對黃瓜植株生長具有顯著的促生效果。LK2-3 處理15 d 后，黃瓜株高和莖粗分別為7.27 cm 和3.55 mm，比對照增加32.18%、54.35%；LK2-3 處理的黃瓜葉鮮質量和干質量分別為6.36 g·株和0.82 g·株，比對照增加160.66%和128.61%；LK2-3 處理的黃瓜根鮮質量和干質量分別比對照增加480.00%和223.33%。接種黃瓜枯萎病菌（FOC）的條件下LK2-3 處理同樣具有顯著的促生效果（表2）。說明LK2-3 處理不僅能夠防治黃瓜枯萎病，而且對黃瓜植株生長和根系發育也具有明顯的促進作用，由圖3和圖4 也可看出LK2-3 處理明顯促進了黃瓜地上部生長和根系發育。

表2 LK2-3 對黃瓜的促生效果

圖4 LK2-3 處理15 d 對黃瓜的促生效果

2.4 LK2-3的定殖密度

進行盆栽試驗測定LK2-3 根際定殖密度的結果，處理15 d 后LK2-3 在黃瓜根系和根際土壤的定殖密度分別達到1.44×10cfu·g和1.12×10cfu·g（表3），表明LK2-3 在黃瓜根系和根際土壤具有穩定的定殖密度，為其發揮促生防病作用奠定了基礎。

表3 LK2-3 在黃瓜根際定殖密度

2.5 LK2-3的鑒定

LK2-3 在TSA 培養基上產生白色、不透明、表面不光滑、邊緣不規則的菌落（圖5）。LK2-3 的菌體為直桿狀，革蘭氏陽性，產芽孢，在5～50 ℃范圍內均能生長，最高耐鹽濃度為11%，可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、L-阿拉伯糖、丙酸鹽、丁酸鹽和山梨醇，硝酸鹽還原反應、明膠液化、淀粉水解反應、過氧化氫酶試驗均呈陽性，亞硝酸鹽還原反應呈陰性（表4）。另外，以LK2-3 菌株總RNA 為模板，PCR 擴增出的16S rRNA 長度約為1.5 kb，對其序列進行NCBI BLAST 比對，結果顯示，與枯草芽孢桿菌16S rRNA 序列同源性達到99%。利用MEGA 軟件構建其系統發育樹，結果顯示，與枯草芽孢桿菌（LC506466.1）在一個分支，其支持度為99%（圖6）。因此，根據其形態特征、生理生化特性和16S rRNA 序列同源性分析，將LK2-3 菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（）。

圖6 LK2-3 的系統發育樹

表4 LK2-3 的形態特征和生理生化特性

圖5 LK2-3 的培養形態

3 討論與結論

黃瓜枯萎病菌是由厚垣孢子在土壤中長期存活，土壤中的菌絲和厚垣孢子萌發從植物根或根莖部侵入，在維管束內寄生的一種系統性病害。在枯萎病菌的生活史中能夠抑制任何一個發育階段都是防治枯萎病的有效途徑。圓圓等發現，生防菌S-101 不僅能抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長，又能抑制孢子萌發，從而抑制病原菌的無性繁殖；李晶等發現，枯草芽孢桿菌B29 菌株不僅能抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長，又能抑制孢子萌發，對黃瓜枯萎病有顯著的防治效果。本研究結果表明，LK2-3 菌株能夠抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發，能夠有效切斷枯萎病菌的繁殖，有效防治黃瓜枯萎病，同時，LK2-3 對黃瓜植株生長表現明顯的促進作用，顯示出良好的生防潛力。

生防菌的根際定殖能力是其發揮效果的前提，其在植物根際定殖能力的強弱及穩定性是決定生物防治成功與否的關鍵，決定了其潛在生防作用的大小。生防菌的定殖包括兩個方面，一是能夠在植物根際生存下來，二是能適應植物根際環境而大量繁殖。連玲麗等發現，枯草芽孢桿菌（.）EN5 可以在其自然寄主番茄的根、莖及根際土壤中穩定定殖，顯著改善根際土壤微生態環境，抑制病菌繁殖；王晶晶等發現，普城沙雷菌（）K9-3 和綠針假單胞菌（）L14-2 均具有良好的根際定殖能力，能有效防治煙草黑脛病；劉錦霞等發現，枯草芽孢桿菌（.）SW11 表現出很強的抗逆和復雜生態環境適應能力，既可以在番茄根際土壤中定殖生存，又可以定殖于番茄植株的各個部位，成為番茄植株及其根際的有益微生物種群之一，顯示了良好的開發應用潛力。本研究結果表明，LK2-3 菌株在黃瓜根系和根際土壤成功定殖，且在根系和根際土壤能夠保持10cfu·g和10cfu·g的定殖密度，具有良好的定殖能力。

芽孢桿菌因具有生長速度快、營養需求簡單、有較強的耐熱性及抗逆性、在植物表面易于存活與繁殖、制劑的穩定性良好等優點成為植物病害生物防治中研究應用最多，同時靶標病害種類也比較多的一類生防細菌。如，蠟質芽孢桿菌（.）AR156 對水稻紋枯病具有較好的防治效果，側孢芽孢桿菌（.）B113 對番茄早疫病有較好的防治效果，多粘類芽孢桿菌（）CF05 對鐵皮石斛細菌性葉斑病具有防治效果，枯草芽孢桿菌（.）B-33 對稻瘟病菌具有抑制作用。本試驗中篩選的LK2-3 是枯草芽孢桿菌（.），能產生芽孢，具有較強的抗逆性，在黃瓜枯萎病防治方面具有很好的應用潛力。

綜上所述，枯草芽孢桿菌LK2-3 對枯萎病菌的抑菌活性較高，具有良好的定殖能力，可有效防治黃瓜枯萎病，可促進植物生長，有較好的應用潛力。生防細菌的防病促生機制是多方面的，是生防細菌的推廣應用的基礎。下一步需要深入研究LK2-3 菌株的防病促生機制，并進一步探究其高效利用技術，為黃瓜枯萎病的綠色防控提供重要的理論和技術支撐。