基于拮抗及ITS 序列分析的河南香菇主產區種質資源鑒定及遺傳多樣性分析

崔 筱，劉 芹，孔維麗，張玉亭，胡素娟，王彥坡，康源春，孔維威，袁瑞奇

（1.河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所 鄭州 450002； 2.西峽縣食用菌生產辦公室 河南 西峽 474599）

香菇（）隸屬于真菌門擔子菌綱香菇屬，是世界上重要的食用菌栽培品種之一。中國是世界上最大的香菇生產國，2020 年我國香菇總產量為1 188.21 萬t，占全國食用菌生產總量（4 061.43 萬t）的29.26%。我國香菇生產基地分布于河南、河北、湖北、浙江、福建、貴州、黑龍江等省，其中，河南省2020 年香菇產量為365.08 萬t，占河南省食用菌產量（561.85 萬t）的64.98%，居全國第一位。河南省香菇栽培主要分布在南陽西峽、南召、桐柏，三門峽盧氏、靈寶，駐馬店泌陽、驛城區，平頂山汝州、魯山等地，栽培規模接近30 億棒。但生產中由于引種混亂，同名異種、同種異名現象頻發，傷農害農事件屢次出現。河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所食用菌團隊前期采用模糊數學和聚類分析的方法對河南省種質資源庫保存的香菇表型性狀進行評價，但無法確定品種基因序列遺傳差異，厘清菌株之間的差異性、避免香菇菌株的混淆是推動香菇產業健康發展的必要路徑。隨著分子生物技術的發展，SSR、RAPD、ITS等方法在香菇、平菇、靈芝等食用菌種群的系統發育和遺傳多樣性鑒定中廣泛應用。而拮抗法是傳統的菌株鑒定方法，傳統鑒定和分子生物學鑒定相結合能夠較好地鑒定食用菌種內種質資源的特異性。前期，筆者已通過“拮抗+ITS”序列分析相結合的方法鑒定了54 個平菇菌株，筆者以河南省內香菇生產大縣的不同菌種企業和栽培基地收集到的41 份香菇菌株為研究對象，應用“ITS+拮抗”相結合的方法進行菌種鑒定和遺傳多樣性分析，進而為香菇種質資源鑒定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

參試菌株為收集的河南省內栽培香菇菌株41個，編號及來源見表1。

表1 供試香菇菌株

母種培養基為PDA 綜合培養基，購自北京奧博星生物技術有限責任公司的PDA 基礎培養基40 g·L，蛋白胨2 g·L，KHPO1 g·L，MgSO0.5 g·L。主要試劑及引物為PCR Master Mix聚合酶、DNA 純化試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 擴增試劑及4sGelRed 染液，均購自上海生工有限公司；pMD-18T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態細胞購自寶生物工程（大連）有限公司；rDNA ITS 分析所用的ITS 通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗試驗 2021 年6—8 月收集河南省科研單位、企業及種植戶栽培的香菇品種，2021 年10月，在河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所將收集到的41 份香菇菌株在PDA 綜合培養基上經活化后，采用直徑5 mm 的打孔器打取各菌株種塊于直徑90 mm 培養皿內對峙培養，每皿放置6個菌塊，種塊間距1.0 cm，每個菌株3 次重復，于25 ℃培養7 d，按照拮抗試驗國家標準的方法觀察記錄41 份參試菌株兩兩之間的拮抗線的形態。

1.2.2 DNA提取 將培養的香菇菌絲體置于1.5 mL無菌離心管中，在全自動快速研磨儀中研磨成粉，提取各樣品的基因組DNA，基因組DNA 提取采用微波法，采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測DNA 樣品質量和濃度，-20 ℃保存備用。

1.2.3 PCR 擴增 選用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 反應體系：DNA 模板1.0 μL，PCR Master Mix 聚合酶12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L）各1.0 μL，ddHO 4.5 μL。反應程序：95 ℃5 min，95 ℃1 min，58 ℃30 s，72 ℃50 s，72 ℃10 min，30 個循環。

1.2.4 PCR 產物檢測及測序擴增 反應完畢后，取5.0 μL 的PCR 產物與1.0 μL 4sGelRed 染液混合，加樣于瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電泳結束后，全自動凝膠成像分析儀JS-680D 下檢測擴增條帶。回收正確的擴增條帶（700～800 bp）連于pMD-18T 載體上，將連接產物轉化于大腸桿菌（）DH5α 菌株感受態細胞，涂布在含有Amp 的LB 固體培養基上，37 ℃培養過夜，菌落PCR 法驗證單克隆大腸桿菌菌株，將驗證正確的大腸桿菌菌株送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.5 數據分析 測序獲得的序列經DNAMAN 軟件多序列比對重排后，于NCBI 數據庫上比對，采用MEGA-X 軟件計算遺傳距離，以Genebank 中平菇（）為外類群，構建基于ITS 序列的系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 拮抗結果分析

41 個香菇菌株共設計拮抗組合861 組，拮抗現象明顯的有480 組，占55.75%；拮抗現象不明顯的有298 組，占34.61%；無拮抗的有83 組，占9.64%。其中，香9608（LE-1）、香931-2（LE-2）、慶元2 號（LE-10）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、靈仙1 號-1（LE-25）、香931（LE-34）、香升龍1-1（LE-37）、香856（LE-38）、香泌陽18-1（LE-39）、泌陽17（LE-40）、香泌陽18-2（LE-41）之間無拮抗，與其他各菌株之間拮抗明顯，表明這些菌株親緣關系較近，初步鑒定為同一菌株；同理，朕迪CGL-10（LE-20）、豫香1 號（LE-31）之間無拮抗，與其他各菌株之間拮抗明顯，表明這些菌株親緣關系較近，為同一菌株；DM-18（LE-24）、靈仙1 號-3 分（LE-27）之間無拮抗，與其他各菌株之間拮抗，明顯被鑒定為同一菌株；靈仙1 號（LE-4）、靈仙1 號-5（LE-5）、雨花3 號（LE-6）、申香215（LE-8）、朕迪XZL-3（LE-17）、朕迪ZSL-8（LE-18）之間無拮抗，與其他各菌株間拮抗不明顯，鑒定為同一菌株；L18（LE-3）、滬農1 號（LE- 9）、朕 迪CGL- 9（LE- 19）、朕 迪CGL- 11（LE-21）、朕 迪DM-12（LE-22）、朕 迪DM-13（LE-23）、靈仙1 號-2（LE-26）、南山1 號-3（LE-28）、香菇分（LE-29）、盧香（LE-30）、香808（LE-33）、香ZX-4（LE-35）、香939 1-2（LE-36）與其他各菌株之間拮抗明顯，表明這些菌株親緣關系較遠；武香1 號-2（LE-7）、香25（LE-11）、香27（LE-12）、香平頂18-04（LE-15）、朕迪XZL-2（LE-16）、夏1（LE-32）與其他各菌株間拮抗不明顯，鑒定為疑似同一菌株。拮抗試驗結果可將41 個香菇菌株初步分為16 個不同菌株及7 個不同亞種（圖1～2）。

圖1 41 個香菇菌株拮抗試驗結果

2.2 rDNA ITS區段PCR測序及NCBI比對結果

41 株香菇菌株的rDNA ITS 區段PCR 擴增均擴增到了目的條帶。經電泳檢測，擴增條帶在700～800 bp 之間，符合測序要求。經檢驗條帶正確的陽性克隆菌液測序后，將測序正確的核酸序列提交到NCBI 數據庫獲得Genebank 登錄號，并與Genebank 核酸序列數據庫進行BLAST 比對，得到與其最相似的物種名、登記號及序列相似性。結果表明，41 個菌株核酸序列在NCBI 上的序列相似性在99.17%～100%（表2），均為香菇.。

表2 供試菌株在NCBI 數據庫中比對結果

2.3 各菌株ITS序列比對分析

圖2 香菇部分拮抗試驗結果

將經測序的香菇屬的41 個菌株之間進一步進行ITS 序列比對分析，結果表明，滬農1 號（LE-9）與其他各菌株的序列相似性在95.97%～96.4%，為單一菌株；香931-2（LE-2）、靈仙1 號（LE-4）、靈仙1號-5（LE-5）、申香215（LE-8）、香27（LE-12）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、香平頂18-04（LE-15）、朕迪XZL-2（LE-16）、朕迪ZSL-8（LE-18）、朕迪CGL-9（LE-19）、朕 迪CGL-10（LE-20）、朕 迪CGL-11（LE-21）、朕迪DM-12（LE-22）、朕迪DM-13（LE-23）、朕 迪DM-18（LE-24）、靈 仙1 號-1（LE-25）、靈仙1 號-2（LE-26）、靈仙1 號-3 分（LE-27）、香菇分（LE-29）、盧香（LE-30）、夏1（LE-32）、香808（LE-33）、香ZX-4（LE-35）、香939 1-2（LE-36）、香升龍1-1（LE-37）、香856（LE-38）、香泌陽18-1（LE-39）、泌陽17（LE-40）、香泌陽18-2（LE-41）與其他菌株之間的序列相似性在99.9%～100%，為同一菌株；L18（LE-3）與南山1 號-3（LE-28）序列相似性為100%，為同一菌株；香9608（LE-1）、雨花3 號（LE-6）、武香1 號-2（LE-7）、慶元2 號（LE-10）、香25（LE-11）、朕迪XZL-3（LE-17）、豫香1 號（LE-31）、香931（LE-34）與其他菌株序列相似性在98.07%～99.86%之間，為不同的亞種；41 個菌株可分為3 個不同的菌株和8 個不同的亞種。

2.4 基于ITS序列的系統發育分析

經測序獲得41 株供試菌的ITS 序列長度為718～724 bp，與GeneBank 數據庫中的香菇菌種的ITS 序列相似度為99%以上（表2），初步認定41 株供試菌株為香菇菌株。根據Kimura-2 參數的遺傳距離模型計算各樣本序列間的遺傳距離（數據未提供），41 份香菇的遺傳距離在0.000 0～0.006 5 之間。其中，滬農1 號與其他菌株的遺傳距離在0.000 0～0.004 8 之間，香9608（LE-1）與豫香1 號（LE-31）的遺傳距離最遠，為0.006 5，且豫香1 號與其他各菌株的遺傳距離在0.003 232～0.004 8 之間，遺傳距離也較遠；香931-2（LE-2）、L18（LE-3）、滬農1 號（LE-9）、慶元2 號（LE-10）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、朕迪XZL-2（LE-16）、朕迪DM-13（LE-23）、靈仙1 號-1（LE-25）、夏1（LE-32）、香931（LE-34）、香939 1-2（LE-36）與其他各菌株的遺傳距離在0.001 6～0.004 8 之間，遺傳距離相對較遠。在Genebank 中下載平菇.（KY962509）ITS序列，長度為640 bp，將其作為外類群，與各香菇菌株的遺傳距離為0.374，種間遺傳距離遠大于種內遺傳距離。

以平菇.為組外對照，與41 份香菇種質資源的ITS 序列構建NJ 系統進化樹（圖3），分析系統進化樹的數值結果可以發現，41 份香菇品種可以聚為4 個大類，4 個大類遺傳關系相對較遠、獨立進化。其中，朕迪XZL-2（LE-16）、滬農1 號（LE-9）各自獨立為一支。香泌陽18-2（LE-41）、香931（LE-34）、泌 陽17（LE-40）、香 泌 陽18-1（LE-39）、香856（LE-38）、香升龍1-1（LE-37）、南山1 號-3（LE-28）、靈 仙1 號-1（LE-25）、香LS-1（LE-14）、L18（LE-3）、香931-2（LE-2）、香939（LE-13）、慶元2 號（LE-10）、香9608（LE-1）聚為一支；香931（LE-34）、香泌陽18-2（LE-41）2 個菌株組成姐妹群，其自展支持強度為39，且與泌陽17（LE-40）親緣關系較近；香9608（LE-1）、慶元2 號（LE-10）、香939（LE-13）3 個菌株組成一個單系類群，其自展支持強度為50，親緣關系較近。其余25個品種為第四支，其中，香808（LE-33）、香ZX-4（LE-35）2 個菌株組成姐妹群，其自展支持強度為3；盧香（LE-30）、豫香1 號（LE-31）、香9391-2（LE-36）3 個菌株組成一個單系類群，其自展支持強度為6，親緣關系較近。

圖3 基于41 份香菇菌株ITS 序列構建的系統發育樹

3 討論與結論

香菇在我國人工栽培歷史悠久，是我國主要的食用菌栽培品種之一。隨著國家精準扶貧策略的推進，香菇短、平、快的生產特性及較高的經濟效益，驅動我國的香菇產業進入了快速發展階段。河南省是香菇生產大省，隨著產業發展，菌種作為食用菌產業的核心，同種異名、同名異種、菌種間遺傳關系問題一直未得到有效的解決，因此對香菇建立快速準確的鑒定方法是十分必要的。

微生物與微生物之間拮抗現象是一個復雜的反應過程，具有防止遺傳上明顯不同的個體間融合的作用，以保持個體遺傳上的穩定性。拮抗反應試驗可用于菌株之間親緣關系遠近的預測，在真菌分類學上被廣泛應用。筆者對河南省內香菇主產區栽培的種質資源進行拮抗試驗。結果表明，41 個香菇菌株可確定為16 個不同菌株及7 個不同的亞種。其中在西峽、泌陽、盧氏香菇種植基地收集到的香菇菌株雖然命名不同，分別命名為香9608、香931-2、香939、香LS-1、靈仙1 號-1、香931、香升龍1-1、香856、香泌陽18-1、泌陽17、香泌陽18-2，但這些菌株之間并無拮抗現象，可初步認定為同一菌株。在汝州收集到的命名為朕迪CGL-10 的菌株與三門峽市農業科學院保藏菌株豫香1 號無拮抗現象，可初步認定為同一菌株。在汝州收集到的命名為朕迪DM-18 的菌株與在靈寶香菇基地命名為靈仙1號-3 分的菌株之間無拮抗現象，可初步認定為同一菌株。在西峽、驛城區、泌陽、上海市農科院、汝州收集到的命名為靈仙1 號、靈仙1 號-5、雨花3 號、申香215、朕迪XZL-3、朕迪ZSL-8 菌株之間無拮抗現象，可初步認定為同一菌株；認定為同一菌株的菌株之間還需要借鑒分子生物學測序結果進一步比對。此外，雖然三門峽市農科院保存的菌株靈仙1 號-1 與西峽及驛城區的靈仙1 號香菇菌株名稱相同，但二者拮抗現象明顯，可初步認定為不同菌株。由此可見，雖然菌株間命名不同，可能為同一菌株，命名相同，卻不一定是同一菌株。

物種內的遺傳距離越小，則其用DNA 條形碼進行分類和鑒定的效果越理想，ITS 序列在種間變異大，種內保守性高，其中，ITS2 序列片段較短，容易與單對引物結合，易于測序與擴增，且種間變異度高，在物種和亞種水平上的識別信息最為豐富，作為一種通用的DNA 條形碼，在植物中已被用于近緣種的鑒定，在絲狀真菌中，也作為菌種鑒定的一種手段。筆者前期對河南省山區部分野生食藥用菌種質資源鑒定分析得出，菌株間序列相似性≥99.9%的定義為同一菌株，序列相似性為99.0%～99.9%的定義為不同亞種，序列相似性為95%～99%鑒別為相同屬的不同菌株。筆者對本試驗中41 份樣本進行DNA 提取、PCR 測序，并成功獲得ITS 序列，ITS 測序分析表明，41 個菌株可分為3 個不同的菌株和8 個不同的亞種，與前面拮抗試驗香931-2（LE-2）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、靈仙1 號-1（LE-25）、香升龍1-1（LE-37）、香856（LE-38）、香泌陽18-1（LE-39）、泌陽17（LE-40）、香泌陽18-2（LE-41）為相同菌株，DM-18（LE-24）與靈仙1 號-3 分（LE-27）為相同菌株，靈仙1 號（LE-4）、靈仙1 號-5（LE-5）、申香215（LE-8）為相同菌株及雨花3 號（LE-6）、武香1 號-2（LE-7）、香25（LE-11）、朕迪XZL-3（LE-17）與其他菌株為不同亞種的結果一致，更進一步印證了無拮抗現象的菌株間距離的遠近。此結果與前期平菇種質資源的遺傳多樣性分析結果相似，通過“拮抗＋ITS”法，可將41 份香菇菌株確定為26 個不同菌株及4 個不同亞種。本試驗結果表明，該方法可以有效地鑒定香菇種類，基本解決了河南省內香菇品種命名混亂的問題。

使用MEGA7.0 軟件對41 株種內遺傳距離進行計算，種內遺傳距離在0.000 0～0.006 5 之間，引用外源種.（KY962509）ITS 序列作為外類群，與各香菇菌株的遺傳距離為0.374，種間遺傳距離明顯大于種內遺傳距離，說明可以使用ITS 對供試樣本進行分析鑒別。以平菇.為組外對照，與41 份香菇種質資源的ITS 序列構建NJ 系統進化樹，41 份香菇品種可以聚為4 個大類，4 個大類遺傳關系相對較遠、獨立進化，同時能夠觀察到不同種親緣關系的遠近程度。

“ITS+拮抗法”結合可以明確地區分菌株間拮抗、無拮抗及拮抗不明顯現象基因序列的相似度，遺傳距離的差異及親緣關系的遠近，本研究結果可為厘清河南省香菇品種提供理論支撐。