堿性蛋白酶控制酶解誘導大豆分離蛋白納米顆粒的形成機制

鐘 敏，常方圓，趙謀明，周非白*

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

生物酶解是一種綠色有效的蛋白質改性手段，可以顯著提高蛋白質在抗氧化、調節血脂水平與免疫力等方面的生理活性，通過控制酶解程度還可以提高蛋白質的功能特性，如溶解性、發泡性、乳化性與凝膠性等，是蛋白質精深加工領域的研究重點。近年來研究發現，蛋白質在酶解過程中形成的兩親性結構可自組裝形成多種納微結構，如纖維、納米管、膠束、球形顆粒等，在食源性功能因子的穩態及新型蛋白基食品體系的構建等方面顯示出極大的應用潛力，拓寬了蛋白質在功能性食品領域的開發及應用。

酶解誘導蛋白自組裝受到多種因素的共同影響，如底物蛋白的特性、酶的特異性、水解程度、外界環境等。研究發現pH值、蛋白質濃度和Ca都會影響部分水解的-乳清蛋白組裝形成納米管，分別影響納米管的形成速度、數量及結構的硬度；Gao Yuzhe等發現分別經胰蛋白酶、蛋白酶A、胃蛋白酶和蛋白酶M處理的乳清蛋白形成納米纖維結構的能力不同；Nicklas等利用堿性蛋白酶對膠原蛋白處理18～168 h，發現控制酶解時間可以得到不同粒徑的膠原蛋白納米顆粒。目前利用生物酶解技術誘導蛋白組裝的研究多集中于動物蛋白。EATLancet委員會于2019年發布首份全球健康膳食和可持續食物生產的通用科學標準，對植物蛋白質的開發與應用提出新要求，其中大豆蛋白作為優質植物蛋白來源受到廣泛關注。與乳蛋白等動物蛋白相比，天然大豆蛋白組分復雜，球狀結構致密，疏水區域分布較廣，而且不同亞基酶解敏感性不同，使得各組分酶解過程不同步且酶解程度不易控制。如大豆球蛋白（11S）中堿性亞基大多被包埋在酸性亞基內部，親水外側酸性亞基通常優先被降解，而相關研究卻發現11S酶解誘導聚集體的形成主要來源于堿性多肽鏈的肽段；Inouye等對比研究了-伴大豆球蛋白（7S）和11S的酶解聚集規律，發現在中性條件下，11S酶解產生的肽段比7S的酶解肽段更容易聚集，而Kuipers等發現7S具有抑制11S酶解肽的聚集效果。酶解過程中亞基的暴露與降解程度、所生成肽段的序列與帶電性以及各組成成分之間的相互作用均影響蛋白的組裝行為，如何利用生物酶解技術構建有序的大豆蛋白基納微結構仍待進一步研究。

課題組前期研究結果表明，大豆蛋白在酶解過程中產生的多肽類結構經超聲誘導可進一步組裝形成約100 nm的大豆肽基納米顆粒；進一步研究發現，利用風味蛋白酶、堿性蛋白酶以及復合蛋白酶控制酶解大豆蛋白結合熱作用可以成功制備蛋白納米顆粒，其中酶種類和水解度（degree of hydrolysis，DH）對顆粒的形成都極為關鍵，而堿性蛋白酶作用下大豆蛋白的組裝行為具有特異性。堿性蛋白酶作為目前應用最廣的一種商業酶制劑，常應用于改善與提升蛋白質的營養和功能性，如堿性蛋白酶酶解大豆蛋白可以顯著提升其抗氧化活性，并且有效減輕炎癥癥狀。此外，堿性蛋白酶控制酶解蛋白可形成更多疏水性單元結構與更小粒徑的兩親性肽段，在構建多功能納微尺度的生物材料方面具有較大潛力，其作用下蛋白的組裝行為及機制值得探究。因此，在前期研究的基礎上，以堿性蛋白酶作為大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）原料的水解酶，探究SPI的結構變化規律，進一步明晰其自組裝形成大豆蛋白納米顆粒（soy protein nanoparticles，SPNs）的機制，以期為新型大豆蛋白基功能載體的構建提供一定理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕（蛋白質約45%） 山東禹王實業有限公司；堿性蛋白酶2.4 L（酶活力＞200h10U/g） 丹麥諾維信公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、尿素 美國Geniview公司；鄰苯二甲醛（-phthalaldehyde，OPA）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、熒光素二鈉、Trolox 美國Sigma-Aldrich公司；蛋白質預染Marker（10～180 kDa） 廣州鼎國生物技術有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

THZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；pHS-25 pH計 瑞士Mettler Toledo公司；CR22N高速冷凍離心機、HT7700場發射透射電鏡、F7000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Alpha 2-4 LDplus真空冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；Nano-ZS納米粒度及Zeta電勢分析儀 英國Malvern公司；Chirascan圓二色光譜（circular dichroism，CD）儀 英國Applied Photophysics公司；Mini-PROTEIN 3 Cell電泳儀 美國Bio-Rad Laboratories公司；C300化學發光分子成像系統美國Azure Biosysterms公司；UV754N紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的提取

采用常規堿溶酸沉的方法：將低溫脫脂豆粕粉碎成細小的粉末，過篩收集。豆粕粉與去離子水按1∶10的質量比進行分散，室溫攪拌2 h并且過程中維持pH 8.0左右。然后10 000h、4 ℃離心20 min，過濾收集上清液，調節pH 4.5，4 ℃靜置30 min后，按照上述條件進行離心，棄去上清液，并用去離子水清洗沉淀表面2 次，加入沉淀質量7 倍的去離子水緩慢攪拌，維持pH 7.5左右，蛋白充分分散后于4 ℃透析48 h，冷凍干燥備用。

1.3.2 堿性蛋白酶酶解處理SPI

準確稱取一定量的SPI于去離子水中配成40 mg/mL的蛋白分散液，室溫攪拌分散2 h充分水化，加入堿性蛋白酶酶解。酶解條件：pH 8.0，酶解溫度55 ℃，加酶量為蛋白質量的0.1%。于固定時間（10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h）取樣，樣品調節pH 7.0后立即置于沸水浴（100 ℃）滅酶10 min。樣品冷卻至室溫后10 000h、20 ℃離心15 min，收集上清液，直接用于測試或冷凍干燥備用。

1.3.3 DH的測定

參考Nielsen等的方法，具體步驟為：取400 μL樣品（0.2 mg/mL）與3 mL OPA試劑混合均勻，避光準確反應2 min后于340 nm波長處比色，讀數記為，標準品和空白對照分別用0.951 6 mmol/L絲氨酸溶液和純水代替，測定結果記為和。樣品中的游離氨基表示為絲氨酸氨基當量（Ser NH），DH計算公式如下：

式中：為樣品蛋白質量濃度/（mg/mL）；和分別為0.970和0.342 mequv/g；為蛋白質的總肽鍵數，約為7.8 mequv/g。

1.3.4 粒徑、多相分散系數及Zeta電位測定

采用動態光散射（dynamic light scattering，DLS）技術與電泳光散射技術，將樣品溶液用10 mmol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至0.5 mg/mL后，用Nano-ZS納米粒度儀對樣品的粒徑、多相分散系數（polydispersity index，PDI）及Zeta電位進行測定。所有測定均在25 ℃條件下進行，每個樣品至少測定3 次。

1.3.5 場發射掃描電鏡（field emission scanning electron microscope，FE-SEM）分析

將樣品凍干粉末均勻薄涂一層固定于導電雙面膠上，噴金后通過加速電壓為5 kV的FE-SEM進行微觀形貌觀察。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參考Laemmli的方法：將樣品分別與還原性樣品緩沖液（2 g/100 mL SDS，25%甘油，14.4 mmol/L-巰基乙醇，0.05%溴酚藍；溶于60 mmol/L pH 6.8 Tris-HCl緩沖液）以及非還原樣品緩沖液（不含-巰基乙醇，其他同還原性樣品緩沖液）混合，控制蛋白質最終進樣質量為20 μg。凝膠電泳在恒流25 mA下進行，分離膠和濃縮膠的丙烯酰胺體積分數分別為12%和5%。電泳結束后，進行染色與脫色處理，最終在凝膠成像系統上進行成像拍照。

1.3.7 表面疏水性測定

參考Haskard等的方法，使用ANS作為熒光探針進行測定。具體操作步驟為：將蛋白樣品分散于PBS溶液（10 mmol/L，pH 7.0）中并在室溫下攪拌1 h，然后梯度稀釋配制0.01～0.5 mg/mL的蛋白分散液。向4 mL樣品中加入20 μL ANS溶液（8 mmol/L）并混合均勻，立即通過熒光分光光度計測定樣品的熒光強度，記為FI；未加入ANS樣品的熒光強度，記為FI。設定激發波長為370 nm，發射波長為465 nm，電壓為700 mV，激發和發射的狹縫均設置為5 nm。以FI和FI的差值作為軸，蛋白質濃度作為軸，通過線性回歸分析計算出的斜率即為表面疏水性。

1.3.8 臨界聚集濃度（critical aggregation concentration，CAC）的測定

采用芘熒光探針光譜法測定。準確稱取一定量的芘，用適量乙醇溶解后轉入容量瓶中，定容并搖勻，制得濃度為1h10mol/L的芘乙醇貯備液。取200 μL芘乙醇貯備液于玻璃試管中，于25 ℃烘箱中揮發干乙醇，加入2 mL不同濃度的樣品溶液，超聲10 min，靜置30 min，測定各溶液中芘的熒光發射光譜。激發波長為335 nm，發射波長為350～500 nm，激發和發射狹縫寬分別5 nm和2.5 nm。

式中：為特征峰1（373 nm）的熒光強度；為特征峰3（385 nm）的熒光強度；為低蛋白質量濃度下的/；為高蛋白質量濃度下的/；為樣品濃度；為曲線突變的中點，即蛋白的CAC；Δ為描述Boltzmann曲線突變程度的一個參數，即在突變中點處作曲線的斜率，與、兩條平行于軸的直線相交，兩交點水平距離的1/4值即為Δ。

1.3.9 二級結構分析

1.3.10 相互作用力分析

參考Liu Fu等的方法，將1 g/100 mL蛋白樣品分散于不同變性溶劑（30 mmol/L DTT、0.5% SDS和6 mol/L尿素）或其組合中，作用30 min，觀察蛋白樣品分散液的外觀并測定樣品粒徑的變化，粒徑測定方法參考1.3.4節。

1.3.11 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考Zheng Lin等的方法，將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫避光反應12～16 h制得ABTS陽離子自由基儲備液。將ABTS陽離子自由基儲備液稀釋一定倍數配成工作液。將50 μL蛋白樣品分散液（0.2 mg/mL左右）與150 μL ABTS陽離子自由基工作液混合，30 ℃反應30 min后，使用全波長掃描多功能讀數儀于734 nm波長處測定吸光度。用去離子水代替樣品作為空白對照，并用Trolox溶液作為標準抗氧化劑組作標準曲線。根據標準曲線計算出樣品的ABTS陽離子自由基清除能力。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶控制酶解SPI規律探究

2.1.1 DH與表觀濁度的變化

實驗首先對SPI在0～24 h的酶解過程中蛋白DH及產物表觀濁度的變化進行了探究。由圖1可知，隨著酶解時間的延長，DH整體呈上升趨勢，其增長速率在4 h后逐漸降低并趨于平緩，與王利國、Xia Yichen等的研究結果較一致。此外，0～2 h酶解處理的樣品表觀濁度普遍較高，可能與蛋白膠體顆粒的存在有關，同時，樣品濁度在酶解反應前期（0～1 h）急劇增加并在1 h達到最大，可能與堿性蛋白酶作用下蛋白疏水域的暴露有關，形成大量可溶性聚集體；隨著酶解反應的進一步進行（4～24 h），樣品因產生大量不溶性聚集體及親水性多肽經離心變澄清。

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以表示，組間差異比較采用t檢驗，計數資料以%表示，組間差異比較采用χ2檢驗。

圖1 DH與表觀濁度隨酶解時間的變化Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on DH and apparent turbidity of SPI

2.1.2 粒徑、分散性、微觀形貌及電位的變化

利用DLS技術對經堿性蛋白酶處理的蛋白樣品進行水合半徑粒徑（-average size）和PDI的測定。一般認為，當PDI小于0.3時，所測定體系的均一性較好。由表1及圖2可知，原始SPI粒徑呈現多峰分布，且分散均一性較差（PDI＞0.5）。實驗發現控制酶解10 min～2 h（酶解1 h除外）結合熱處理有利于SPI組裝形成平均粒徑在90～150 nm之間且分布較均一（PDI約0.2）的SPNs。結合表觀濁度結果，酶解1 h樣品未形成顆粒可能與大量可溶性聚集體的形成有關。而酶解4～24 h的樣品粒徑及PDI均較大。

表1 SPI酶解產物的平均粒徑、PDI和Zeta電位Table 1 Average particle sizes, PDI and zeta potential values of SPI hydrolysates

圖2 SPI酶解產物的粒徑分布Fig.2 Changes in particle size distribution of SPI hydrolysates as a function of hydrolysis time

進一步對SPI及酶解樣品進行微觀形貌觀測，FESEM結果顯示，原始SPI尺度較大且形貌不規則成（圖3A）；SPNs樣品（圖3B、C）均以大小均一的球形納米顆粒存在，粒徑較DLS結果小，可能與冷凍干燥處理造成的蛋白皺縮行為有關；而酶解4～24 h（以12 h為例，圖3D）樣品均為粒徑較大的無規則聚集體，這可能與高DH下生成的無定形多肽有關。因此，基于DLS技術測定樣品平均粒徑對于酶解4～24 h樣品可信度較低，暫不予以討論。

圖3 SPI（A）及SPI經堿性蛋白酶酶解10 min（B）、2 h（C）及12 h（D）產物的FE-SEM圖Fig.3 FE-SEM images of native SPI (A) and SPI hydrolyzed by alcalase for 10 min (B), 2 h (C) and 12 h (D)

隨著酶解時間的延長，樣品的Zeta電位值整體呈現出電位絕對值降低的趨勢（表1），其中SPNs的Zeta電位絕對值均大于25 mV（30～35 mV），可以認為體系中有足夠的靜電斥力保持納米懸濁液的穩定。而酶解4～24 h導致產物表面凈電荷的顯著下降，可能與酶解后期親水性多肽的形成有關，而可溶性無定形多肽一般帶電荷較分散且數量較少。以上這些結果表明，堿性蛋白酶酶解處理SPI可控制形成SPNs，DH是影響SPNs形成的關鍵因素。

2.1.3 SDS-PAGE分析

實驗進一步對離心前后的酶解產物進行SDS-PAGE的對比分析，探究堿性蛋白酶作用下SPI亞基的降解及聚集規律。首先分析未經離心處理的酶解樣品以確定各亞基在酶解過程中的降解情況，由圖4可知，在非還原情況下，7S組分在酶解初期其、’亞基就發生了一定程度的降解，并很快降解完全。而亞基對堿性蛋白酶作用相對不敏感，整個酶解過程中亞基條帶基本維持不變。11S組分中經二硫鍵作用形成的、亞基（約58 kDa），其條帶經酶解處理后均消失，表明發生了新的聚集或者降解，同時隨著酶解時間的延長，一條約35 kDa的新條帶出現并在酶解4 h時開始逐漸加深。在還原情況下，酶解0～2 h樣品有相對完整的亞基和亞基，表明在酶解及熱作用下進一步發生了由二硫鍵誘導的聚集。酶解2 h后亞基開始降解，形成新的彌散條帶，而亞基對酶解敏感性較低，結合非還原下SDS-PAGE的結果，亞基與亞基的降解片段可能通過二硫鍵作用形成了約35 kDa的新聚集體。

圖4 經堿性蛋白酶酶解處理的SPI（離心前）電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of SPI treated by alcalase(before centrifugation)

圖5 經堿性蛋白酶酶解處理的SPI（離心后）電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of SPI treated by alcalase (after centrifugation)

進而對經離心處理的酶解樣品進行分析，實驗發現酶解0～1 h的樣品離心前后亞基變化不大（圖4、5），其中酶解10～30 min的樣品僅、’亞基發生部分降解，這有利于蛋白疏水區域的暴露及可溶性聚集體的形成，對應形成了亞基組成相對完整的SPNs（I類）；而酶解1 h所對應的樣品表觀濁度最大（圖1），表明形成最大尺度的可溶性聚集體，可能與與’的全降解相關。酶解2 h后，樣品亞基消失且大部分亞基條帶強度驟降，對應樣品表觀濁度下降，結合離心前亞基與亞基未出現明顯降解的現象，可說明亞基的部分降解進一步促進蛋白疏水相互作用，并促使體系中可溶性聚集體向不溶性疏水聚集體轉化，對應形成了以11S亞基及7S部分亞基為主導的SPNs（II類）。隨著酶解的進一步進行，4～24 h酶解處理的樣品離心后無特征亞基條帶，表明樣品主要以小分子肽組成，與其澄清表觀對應（圖1）。相關研究也發現大豆蛋白不同組分經水解處理后具有不同的聚集行為，Mohri等使用菠蘿蛋白酶在低DH下對SPI及11S進行處理，發現11S的結構主導聚集行為，11S經熱處理后結構展開，強疏水性的堿性亞基暴露于表面，而水解后的片段重新相互作用，將疏水性區域包裹在聚集物內部。上述結果表明，蛋白各組分與亞基的降解程度直接影響SPNs的組成與空間結構。

2.1.4 表面疏水性的變化

通過ANS法測定酶解過程中酶解產物的表面疏水性的變化，結果如圖6所示，隨著酶解時間的延長，酶解產物的表面疏水性表現出先增加后減少的趨勢，酶解前期（10～30 min）增至最大（60 000～80 000），結合酶解過程亞基的降解情況分析，及’亞基的部分降解導致疏水區域的暴露，同時熱變性會引起其結構的伸展并增強二硫鍵作用，二硫鍵周圍常聚集著疏水性氨基酸，從而造成表面疏水性的增加；而隨著酶解時間的延長（1～2 h），及亞基發生疏水聚集，表面疏水區域減少，表面疏水性相對酶解前期有所降低，所以在酶解的不同階段所形成的兩類SPNs具有不同的表面性質；酶解后期（4～24 h）顯著降低，可能是此時體系中親水性多肽占據主導地位，提高了體系的親水性，同時由于肽鍵裂解引起的分子電荷增加導致疏水性（可檢測的）降低，-螺旋與-折疊結構域之間的疏水結合位點丟失也會造成疏水性降低，這與其他類似酶解研究中結果一致。

圖6 SPI酶解產物的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of SPI hydrolysates

根據以上實驗結果，將酶解過程劃分成低DH（0%～4%）、中DH（4%～8%）、高DH（8%～12%）3 個階段以便進行后續顆粒形成機制的相關研究，其中低DH階段形成I類顆粒具有高表面疏水性的SPNs-DH 3%，中DH階段形成II類顆粒親水性更高的SPNs-DH 5%，高DH階段未形成有序的顆粒結構。

2.2 SPNs形成機制探究

2.2.1 CAC分析

芘作為一種強疏水熒光探針，在335 nm激發后其熒光發射光譜有5 個峰，峰1（373 nm）的熒光強度和峰3（385 nm）的熒光強度之比（/）強烈地依賴于其周圍微環境的極性，/值越低則反映芘所處微環境的疏水性越高。從圖7可以看出，當蛋白質量濃度很低時（小于CAC），/值基本不變，這是因為此時蛋白分子以單體或無規則結構存在于水溶液中，其質量濃度的增加對分散于溶液中的芘所處環境的影響不大。隨著蛋白質量濃度的增加，/逐漸降低，通過Boltzmann擬合發現，原始SPI的CAC為0.25 mg/mL，低DH階段SPNs-DH 3%的CAC僅為0.09 mg/mL，此時亞基疏水結構的暴露導致表面疏水性更高（圖6），在較低蛋白質量濃度下即可發生聚集形成顆粒結構；中DH階段II類顆粒SPNs-DH 5%的CAC相對I類顆粒SPNs-DH 3%略有增加（0.25 mg/mL），可能與其表面疏水性的下降有關（圖6）；而高DH階段的CAC顯著增加至11.56 mg/mL，結合表面疏水性的結果也說明體系中親水性結構占據主導地位，疏水相互作用不足以形成有序的納微結構。

圖7 SPI及低、中、高DH酶解樣品的芘發射熒光強度比值（I373 nm/I385 nm）隨蛋白質量濃度變化的Boltzmann擬合函數Fig.7 Boltzmann curves of pyrene fluorescence intensity ratio I373 nm/I385 nm of SPI and hydrolyzed SPI with different DH levels (low, middle and high)against logarithmic protein concentration

2.2.2 二級結構的變化

通過CD分析酶解樣品的二級結構，在堿性蛋白酶作用下，低DH、中DH、高DH下酶解產物的CD圖譜隨DH的增加而明顯往短波長方向移動（圖8），同時負峰逐漸收縮加深；相應地，其-折疊含量隨DH的增加不斷上升，-螺旋和無規卷曲含量相應減少（表2），表明-螺旋和無規卷曲向-折疊結構的轉變，這可能與其、’亞基的降解有關，同時還導致了其-螺旋/-折疊比例的明顯下降，表明其結構柔順性在酶解過程中不斷上升。上述研究結果表明，-螺旋和無規卷曲向-折疊結構的轉變有利于SPNs的形成，并且，與II類顆粒SPNs-DH 5%相比，I類顆粒SPNs-DH 3%的結構剛性更大。

圖8 SPI及低、中、高DH酶解樣品的CD圖Fig.8 CD spectra of SPI and hydrolyzed SPI at different DH levels(low, middle and high)

表2 SPI及低、中、高DH酶解樣品的二級結構組成Table 2 Secondary structure contents of SPI and hydrolyzed SPI at different DH levels (low, middle and high)

2.2.3 相互作用力

一般認為DTT、SDS和尿素可分別破壞蛋白質的二硫鍵、疏水相互作用力以及氫鍵。如圖9所示，經各變性劑處理后，整體而言低DH階段形成的I類顆粒SPNs-DH 3%與中DH階段形成的II類顆粒SPNs-DH 5%的表觀濁度與粒徑變化規律相似，說明維持顆粒結構的整體作用力類似。當SDS單獨作用時，兩類顆粒的粒徑均顯著減小，說明顆粒的整體結構由疏水相互作用力維持。在SDS與DTT共同作用下，顆粒粒徑均比單獨SDS處理小，當SDS將SPNs解聚后，暴露的內部結構在DTT的作用下進一步被打開，說明二硫鍵主要參與穩定顆粒的內部結構。尿素單獨作用時，粒徑略微減小，溶液濁度稍有減小，說明氫鍵主要位于顆粒外部，氫鍵的破壞導致外部結構的部分解離；對比兩類顆粒粒徑變化情況，當DTT與尿素兩者共同作用時，SPNs-DH 3%的粒徑無明顯變化，而SPNs-DH 5%粒徑顯著增加，說明氫鍵與二硫鍵同時被破壞時，SPNs-DH 5%中內部所含的折疊結構發生了展開。

圖9 SPNs在不同蛋白變性溶劑中的外觀和粒徑Fig.9 Appearance and average particle size of SPNs in different protein-denaturing solvents

根據以上實驗結果，推測的SPNs形成途徑模型如圖10所示，低DH下，亞基與亞基通過二硫鍵與疏水相互作用發生聚集，形成了疏水核心。亞基與亞基之間通過二硫鍵作用，形成了顆粒的中間結構。同時低程度酶解使得相對更親水的、’亞基暴露，并包裹于顆粒的表面，在氫鍵的作用下形成了顆粒的最外層結構，另外由于、’亞基具有延伸區域可抑制SPI的聚集，使得I類顆粒SPNs-DH 3%能夠維持均一分布；中DH下，、’亞基完全降解，亞基被暴露出來并且部分降解，原本由亞基與亞基組成的疏水內核發生結構的展開，僅部分亞基可再次組成疏水內核，形成了以部分亞基及兩親性肽為主要表面結構的II類顆粒SPNs-DH 5%；高DH下，由于亞基的持續降解與亞基發生徹底的疏水聚集，內部疏水相互作用不足以使體系中存在的酶解片段形成顆粒結構。

圖10 SPNs-DH 3%及SPNs-DH 5%的形成機理圖Fig.10 Schematic illustration of the formation mechanism of SPNs-DH 3% and SPNs-DH 5%

2.3 抗氧化活性的評價

如圖11所示，經過不同程度酶解后的產物，其抗氧化性較于原始SPI均有所提升，且隨著DH變大有增加的趨勢，結合酶解過程中蛋白亞基組成的變化規律，說明酶解過程中、’亞基以及亞基降解生成的抗氧化性多肽提升了體系的抗氧化性。

圖11 酶解前后ABTS陽離子自由基清除能力的變化Fig.11 Changes in ABTS radical cation scavenging activity of SPI before and after enzymatic hydrolysis

3 結 論

以SPI為原料，利用堿性蛋白酶對其進行控制酶解處理，成功制備了SPNs-DH 3%與SPNs-DH 5%兩類分布均勻（PDI＜0.3）、粒徑可控（90～200 nm）的SPNs，其中DH及亞基解離/降解是顆粒形成的關鍵性因素。I類顆粒SPNs-DH 3%包含相對完整的7S及11S亞基，表面疏水性較原始SPI有顯著提升，且在更低質量濃度下可自組裝形成均一的聚集體，由疏水相互作用維持顆粒的整體結構，氫鍵與二硫鍵維持表面結構與內部結構；II類顆粒SPNs-DH 5%是由亞基及部分亞基主導的親水性膠體顆粒，與I類顆粒SPNs-DH 3%相比，II類顆粒SPNs-DH 5%中形成更多由氫鍵與二硫鍵穩定的折疊結構，而表面疏水性略有下降，CAC略有增加。由于酶解過程中釋放了抗氧化肽段，與SPI相比，所形成的兩類SPNs抗氧化性均有顯著提升。綜上，利用堿性蛋白酶控制酶解SPI可形成不同表面特性的抗氧化蛋白納米顆粒，為生物酶解構建蛋白基顆粒，進一步提升蛋白功能特性與擴大應用范圍提供新方案。