阿特拉津在太平洋牡蠣體內的蓄積、分布與消除

鄭旭穎，孫曉杰*，郭萌萌，邢麗紅，李風鈴，彭吉星，朱盼盼3，李兆新*

（1.農業農村部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.青島大學生命科學學院，山東 青島 266071）

阿特拉津，又名莠去津，化學名為2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪，分子式為CHClN，由于其殺草譜較廣，且成本低、效率高，是三嗪類除草劑中應用最廣泛的一種。因其具有肝臟、免疫、生殖、甚至潛在致癌性等多種毒性效應，對生態環境和人類健康均構成潛在威脅，已成為國際上持續關注的環境問題。

自2003年起，歐盟禁止使用阿特拉津，同時，阿特拉津也被美國環保署列為優先控制污染物名單。但加拿大、澳大利亞等一些國家仍有使用。在農業生產中每年使用約7～9萬 t阿特拉津。目前，阿特拉津已在水體、土壤、生物和食物等不同物質中檢出。根據急性中毒閾值，地表水中阿特拉津的濃度一般不被視為對生態有害，合理的無觀測效應水平為20 μg/L。然而，環境中阿特拉津大部分通過降雨或灌溉進入地下水或地表徑流，最終流至沿海水域。2017年8月29日—9月24日，Yang Liqiang等在中國黃海和渤海設置了64 個站點對阿特拉津等10 種三嗪類除草劑的分布及濃度進行了調查，發現渤海灣地區阿特拉津濃度明顯高于黃海海域，最高濃度為2.50 nmol/L。有研究表明，阿特拉津對魚類具有一定急性毒性，并導致其生長率下降、行為改變、生化和血液學指標等改變。阿特拉津還對其他水生生物有害，如小龍蝦、青蛙、雙殼貝類等。

目前關于阿特拉津在水生生物中的生物富集和消除規律研究已有報道，陳家長等研究了鯽魚多種組織對不同濃度阿特拉津的富集效應，結果表明，當暴露濃度相同時，鯽魚不同組織器官對阿特拉津的富集能力表現為肝臟＞腎臟＞肌肉，且均在19 d對阿特拉津的富集達到穩態。王瑋云等將菲律賓蛤仔分別暴露在質量濃度為1.0、10.0 μg/L和200 μg/L的阿特拉津海水中，發現菲律賓蛤仔中阿特拉津的最大富集系數分別為15.4、6.15和3.56，消除實驗顯示菲律賓蛤仔對阿特拉津具有快速消除能力。此外，在暴露相同阿特拉津質量濃度下，刺參最大富集系數分別為1.77、1.46和1.23，表明貝類對阿特拉津的富集能力遠大于海參。

太平洋牡蠣（）屬濾食性雙殼貝類，通過過濾海水獲取浮游藻類作為食物。因其生長周期短、活動范圍小，可作為監測海洋污染狀況的生物標志物。同時，我國是世界上最大的貝類養殖和出口國家，太平洋牡蠣是國內重要的養殖經濟貝類，而有關阿特拉津在太平洋牡蠣體內的富集和消除效應鮮見報道，阿特拉津在貝類各組織中的富集殘留動態仍缺乏研究。因此，本研究以太平洋牡蠣為實驗生物，研究阿特拉津在太平洋牡蠣閉殼肌、內臟、鰓、外套膜和性腺各組織中的蓄積、分布及消除動態，通過統計分析計算生物富集系數（bioconcentration factor，BCF），更準確地反映各參數影響，以期為深入研究阿特拉津對水生生物的危害程度和作用機理提供基礎性資料，為研究阿特拉津在貝類各組織中富集分布及代謝途徑提供參考，同時也為雙殼貝類食品安全風險評估和海洋生態環境保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用太平洋牡蠣取自青島膠南貝類養殖基地，選取體長12～15 cm、健康均一的1.5～2 齡牡蠣。實驗前將太平洋牡蠣在實驗條件下（（20f5）℃）暫養1 周，每天更換1 次水，定時投喂螺旋藻粉1 次，日投餌量約為30 mg/（天·只），期間連續充氧。馴養期間及時清除狀態不佳和死亡個體，選擇活動性強的健康太平洋牡蠣進行實驗。

實驗海水取自青島近海的黃海海域，水溫（18f2）℃，鹽度25‰～30‰，溶解氧6.5～7.0 mg/L，pH 7.8～8.5，實驗用水符合GB 11607ü1989《漁業水質標準》。

阿特拉津標準品、-阿特拉津皆（純度＞96%）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、水（均為質譜級）德國Merck公司；甲酸（HPLC級） 美國Sigma公司；其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

QTRAP 5500三重四極桿復合線性離子阱質譜儀美國AB Sciex公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫大儀器廠；Himac CR 22GII高速離心機 日本Hitachi公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 暴露實驗設計

分別設置10 μg/L和100 μg/L 2 個質量濃度的暴露實驗組和1 個空白對照組，其中暴露階段為15 d，代謝消除階段為14 d。每個實驗水箱（80 L）內注入新鮮海水40 L，加入適量的阿特拉津儲備液（二甲基亞砜溶解），使水體中的阿特拉津最終質量濃度分別為0、10 μg/L和100 μg/L，命名為空白對照組、實驗組1和實驗組2。各放入經暫養的健康太平洋牡蠣110 只。采用半靜態水質接觸染毒法，每24 h更換一半含相同質量濃度阿特拉津的海水，并投喂一次螺旋藻粉。分別在暴露實驗開始后的第6、12小時以及第1、2、3、5、7、10、15天取樣，每個時間點從各水箱內隨機取出太平洋牡蠣樣品6 只，2 只為一個樣本，分成3 個平行樣本，迅速解剖分離為閉殼肌、內臟、鰓、外套膜和性腺5 個組織，并于－80 ℃冷凍密封保存。暴露實驗結束后進行太平洋牡蠣體內阿特拉津的消除實驗，把所有實驗水箱換成清潔海水，分別在換水結束后的第1、2、3、5、7、10、14天進行取樣，取樣方法和保存條件與暴露階段一致。實驗過程中及時撈出死亡的太平洋牡蠣個體。為研究阿特拉津分別在環境及太平洋牡蠣體內的消除過程，設置空白海水中添加100 μg/L阿特拉津的實驗組S，與上述實驗組2進行對照。

1.3.2 樣品預處理

太平洋牡蠣組織樣品及糞便：分別準確稱取2 g樣品于15 mL離心管中，加入50 μL內標溶液（1 μg/mL），5 mL 80%乙腈溶液，渦旋混勻，超聲提取2 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液；剩余殘渣加入5 mL 80%乙腈溶液重復提取1 次，合并2 次上清液。上清液中加入5 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，4 500 r/min離心5 min，取上清液于40 ℃氮氣吹干，用1 mL初始流動相復溶，15 000 r/min離心10 min，過0.22 μm濾膜，待測。

空白海水樣品：采用HLB固相萃取柱富集凈化（使用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化），取10 mL水樣，加入50 μL內標溶液（1 μg/mL），上柱富集，然后用3 mL的3%甲醇溶液淋洗，擠干后，6 mL甲醇洗脫，40 ℃氮氣吹干，1 mL初始流動相復溶，渦旋溶解后過0.22 μm濾膜，待測。

暴露阿特拉津的海水樣品：同樣采用HLB固相萃取柱富集凈化，如上述活化后，取5 mL水樣，加入50 μL內標溶液（10 μg/mL），上柱富集，然后用3 mL的3%甲醇溶液淋洗，6 mL甲醇洗脫，40 ℃氮氣吹干，10 mL初始流動相復溶后，取1 mL過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.3 儀器分析

液相色譜條件：C色譜柱（150 mmh2.1 mm，2.6 μm）；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；柱溫40 ℃；進樣量10.0 μL；流速0.25 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

質譜條件：電噴霧離子源；多反應監測，正離子模式；噴霧電壓2.8 kV；離子源溫度320 ℃；阿特拉津的定性離子對為/216.1/174.0，定量離子對為/216.1/132，碰撞能分別為18 eV和23 eV。

1.3.4 質量控制

阿特拉津標準曲線的線性范圍為1～200 μg/mL，相關系數（）在0.995以上；太平洋牡蠣樣品檢出限為0.1 μg/kg（＞3），選3 個不同含量的空白太平洋牡蠣加標實驗（0.5、5.0 μg/kg和10 μg/kg，=6），回收率均在70.0%～120%之間；海水樣品檢出限為5.0 ng/L（＞3），加標回收率在70.0%～120%之間（加標量分別為20、100 ng/L和200 ng/L，=6）。

1.4 數據處理

數據分析參考Paterson和崔文杰等的方法。采用Origin 8.5.1非線性擬合方法，將凈化實驗數據擬合到一階衰減模型中，按式（1）、（2）計算凈化速率常數和消除半衰期：

式中：C為時太平洋牡蠣組織中阿特拉津的含量/（ng/g）；C為凈化實驗開始時阿特拉津的含量/（ng/g）；為時間/d；為消除速率常數/d；為消除半衰期/d。

通過將凈化期間計算出的凈化速率常數代入一階生物累積模型，按式（3）計算吸收速率常數（）：

式中：為海水中阿特拉津的質量濃度/（μg/L）；為吸收速率常數/（mL/（g·d））。

BCF按式（4）、（5）計算：

式中：C為時生物組織中化合物的含量/（ng/g）；為化合物溶解在水中的質量濃度/（μg/L）。

太平洋牡蠣組織及糞便中阿特拉津含量以濕質量計，海水中阿特拉津含量以體積計。

2 結果與分析

2.1 阿特拉津在太平洋牡蠣體內的分布特征

如圖1所示，太平洋牡蠣不同組織對阿特拉津的生物富集具有一定差異。富集實驗結束后，10 μg/L暴露質量濃度下太平洋牡蠣各組織中阿特拉津含量峰值排序為鰓＞內臟＞性腺＞外套膜＞閉殼肌。其中鰓內阿特拉津的峰值為（44.01f0.89）ng/g，約為暴露質量濃度的4.4 倍，明顯高于其他組織；內臟和性腺中阿特拉津的峰值接近，約為暴露濃度的3.5 倍左右；外套膜和閉殼肌中阿特拉津的峰值約為暴露濃度的2.8 倍；鰓、內臟、性腺和外套膜富集達到最大值所需時間接近，在富集2～3 d達到峰值，隨后阿特拉津質量濃度持續下降；閉殼肌組織中阿特拉津質量濃度在富集結束后達到最大值。在100 μg/L暴露質量濃度下太平洋牡蠣各組織中阿特拉津含量峰值排序為鰓＞內臟＞外套膜＞性腺＞閉殼肌。與10 μg/L暴露質量濃度下結果相同的是鰓中阿特拉津的峰值明顯高于其他組織，為（323.24f8.34）ng/g，約為暴露質量濃度的3.2 倍，富集達到最大值所需時間為5 d；閉殼肌中阿特拉津的峰值最低。在不同暴露質量濃度下，太平洋牡蠣的鰓是阿特拉津含量最高的組織，其次是內臟。

圖1 不同暴露質量濃度下太平洋牡蠣各組織中阿特拉津含量變化Fig.1 Changes in atrazine contents in tissues of C.gigas at different exposure concentrations

有研究表明，許多污染物主要由鰓吸收，它們可能是環境中有毒物質的最初跡象。鰓作為環境中污染物的主要入口，因此其富集阿特拉津質量濃度最高。這與Dos Santos等研究結果相似：相對于消化腺，蛤蜊的鰓對阿特拉津的作用更敏感。內臟團由多個結構組成，如消化系統、心包（包圍心臟，是穿過心室終腸的一部分）、排泄系統（腎臟有一對導管）、神經系統（由3 對神經節細胞和一對大腦踏板連接物形成）和生殖系統。其中生殖系統由生殖腺組成，具有高濃度的脂質，能夠生物濃縮有機污染物。因此，內臟團被認為是通過胃腸道攝取阿特拉津。阿特拉津通過鰓的滲透進入貝類體內，最后在內臟團中存儲。因此，阿特拉津在鰓中的生物累積可以在短期內反映污染情況，而在內臟團中的生物累積可能表明阿特拉津接觸時間更長。

此外，外套膜和性腺的富集作用強于閉殼肌，阿特拉津在閉殼肌組織中的質量濃度最低。根據這些數據，可以推斷閉殼肌組織不是阿特拉津暴露的靶組織，阿特拉津在閉殼肌組織中的毒性較弱。這與多個研究結果吻合：雙殼貝類外套膜和性腺對重金屬、有機污染物的富集作用強于閉殼肌。

2.2 太平洋牡蠣體內阿特拉津的富集與消除

2.2.1 太平洋牡蠣對阿特拉津的富集和消除規律

由圖2可知，在10 μg/L和100 μg/L兩個暴露質量濃度下，太平洋牡蠣對阿特拉津的富集變化趨勢相同，均表現為先升高后下降至某一水平上下波動。

圖2 阿特拉津在太平洋牡蠣不同組織中的富集與消除過程Fig.2 Accumulation and elimination of atrazine in different tissues of C.gigas

在富集階段，實驗組太平洋牡蠣中阿特拉津的含量極顯著高于空白組（＜0.01）。如圖2所示，太平洋牡蠣各組織中阿特拉津含量均在暴露3～7 d后達到平衡態，中、后期太平洋牡蠣對阿特拉津的吸收逐漸放緩，趨于平衡。在10 μg/L和100 μg/L質量濃度暴露15 d后，閉殼肌中阿特拉津的含量分別為（28.41f0.46）ng/g和（159.13f1.79）ng/g；內臟中阿特拉津的含量分別為（26.48f1.59）ng/g和（218.88f5.97）ng/g；鰓中阿特拉津的含量分別為（31.55f0.78）ng/g和（287.04f7.65）ng/g；外套膜中阿特拉津的含量分別為（26.15f1.11）ng/g和（293.71f5.57）ng/g；性腺中阿特拉津的含量分別為（26.06f1.01）ng/g和（227.49f4.02）ng/g。阿特拉津在太平洋牡蠣體內迅速蓄積，蓄積與暴露質量濃度及組織差異有關。暴露實驗結束后鰓中阿特拉津含量最高。

在凈化階段前期，太平洋牡蠣各組織阿特拉津含量急劇下降，呈線性下降方式。10 μg/L和100 μg/L暴露濃度組凈化1 d后，太平洋牡蠣各組織凈化率分別為90.1%～94.4%和95.4%～97.1%。其中閉殼肌中阿特拉津的含量分別為（1.58f0.18） ng/g和（7.38f1.27） ng/g；內臟中阿特拉津的含量分別為（2.62f0.16）ng/g和（9.98f1.06）ng/g；鰓中阿特拉津的含量分別為（1.98f0.12）ng/g和（9.46f1.17）ng/g；外套膜中阿特拉津的含量分別為（1.93f0.06）ng/g和（8.51f1.16）ng/g；性腺中阿特拉津的含量分別為（2.10f0.08）ng/g和（8.81f1.11）ng/g。顯然，暴露質量濃度較高的實驗組，凈化效果更明顯。隨著凈化時間的延長，太平洋牡蠣體內阿特拉津質量濃度釋放速度減慢。凈化14 d后，2 組暴露質量濃度下太平洋牡蠣各組織中阿特拉津的含量均趨于空白組水平，說明太平洋牡蠣對阿特拉津的清除率較高。

2.2.2 太平洋牡蠣對阿特拉津的富集和消除參數

太平洋牡蠣不同組織對阿特拉津的吸收和凈化符合一階動力學模型，采用非線性擬合的統計方法分析太平洋牡蠣對阿特拉津的富集和消除參數（圖3），各組擬合曲線判定系數范圍為0.700～0.999，說明擬合程度良好。通過非線性曲線擬合得到消除速率常數（）、吸收速率常數（）、半衰期（）和BCF如表2所示。數據顯示，太平洋牡蠣的值隨暴露質量濃度增加而增大，而BCF值隨暴露質量濃度的增加而減小，在太平洋牡蠣各組織中都表現出相同的趨勢。如Paterson等報道，BCF有2 種計算方式，一種是生物組織中化合物的濃度和溶解在水中的濃度之比（式（5））；另一種是生物對化合物的吸收速率常數與生物體內化合物凈化速率常數之比（式（4））。通過動力學模型的統計分析能更準確的反映各參數影響，因此本研究采用第2種計算方式：吸收速率常數與凈化速率常數計算BCF。BCF是描述化學物質在生物體內累積趨勢的重要指標，可以顯示環境污染的風險。結果顯示，BCF隨暴露質量濃度的增加而減小，說明在低質量濃度條件下太平洋牡蠣更容易對阿特拉津產生富集作用，這一現象在無齒蚌及河蜆中均有發現。然而，本研究與徐英江等報道對比發現，相同暴露質量濃度下（10 μg/L）刺參對阿特拉津的最大富集系數為1.46，太平洋牡蠣對阿特拉津的富集系數明顯高于刺參，這說明不同水生動物對阿特拉津的富集能力存在著較大區別，這一差異可能與攝食方式有關。太平洋牡蠣為濾食性雙殼貝類，通過直接濾食海水中的浮游藻類為食。而浮游藻類的大表面積、特殊胞外組分及細胞形態，使得其對阿特拉津具有很高的富集能力。通過食物鏈的傳遞，太平洋牡蠣可快速富集阿特拉津。同時，由于雙殼貝類的血液循環是開放的血管系統（相對于魚類的封閉循環系統），與外來物質的接觸較為充分，因此會快速形成峰值。還有報道稱，阿特拉津的生物累積潛力還取決于其親脂性、生命階段和在生物體內的代謝過程。

表2 阿特拉津在太平洋牡蠣不同組織中的Ku、Kd、t1/2與BCFs值Table 2 Ku, Kd, t1/2 and BCFs of atrazine in different tissues of C.gigas

圖3 太平洋牡蠣在阿特拉津暴露下富集和消除的擬合模型圖Fig.3 Fitted curves for atrazine accumulation and elimination in C.gigas at different exposure concentrations

凈化實驗數據表明，太平洋牡蠣各組織中阿特拉津含量在凈化階段急劇下降，太平洋牡蠣轉移到潔凈海水中后，對阿特拉津的代謝效率遠高于富集效率，導致阿特拉津含量的斷崖式下降。及顯示，相對于低暴露質量濃度，在高暴露質量濃度下太平洋牡蠣對阿特拉津的消除效率更高，排出速率更快。脫離暴露環境后太平洋牡蠣中阿特拉津的含量迅速降至暴露質量濃度下。消除能力不僅與阿特拉津暴露質量濃度有關，同時因生物因素而異，如雙殼貝類物種、健康狀況、過濾率和排泄率，以及其他非生物因素，如水溫、凈化時間等。此外，動力學參數顯示，在不同暴露質量濃度下，鰓和外套膜的消除速率常數較高，說明凈化過程養殖海水樣品中阿特拉津來源途徑主要是鰓的濾食與呼吸作用或外套膜與海水的大面積接觸。鰓是可滲透的器官，用于吸收或調節離子，吸收溶解氧或釋放二氧化碳和氨，并在一定程度上允許其他物質通過。鰓除了是呼吸器官，同時也是重要的排泄器官。

2.3 太平洋牡蠣體內阿特拉津的消除途徑

針對實驗組S（未養殖太平洋牡蠣的暴露海水組）和實驗組2（暴露阿特拉津的太平洋牡蠣組）海水中阿特拉津含量進行比較（圖4），0～15 d內含量變化較小，說明海水中暴露的阿特拉津較為穩定，主要以原藥形式存在。而太平洋牡蠣在暴露阿特拉津階段，實驗組S的海水中阿特拉津含量均高于實驗組2中的含量，推測實驗組2海水中部分阿特拉津已被太平洋牡蠣吸收或轉化，其阿特拉津含量在5～15 d趨于穩定，與組織中含量穩定的時間段一致，表明5 d后阿特拉津含量在太平洋牡蠣體內已達到平衡。結合圖2和圖4b發現，凈化消除14 d后太平洋牡蠣體內阿特拉津含量低于日本對水產品（魚）的最高殘留限量標準0.01 mg/kg，消除率大于90%，并仍繼續通過呼吸、濾食和糞便等排出體外。表明太平洋牡蠣吸收阿特拉津后將有多種轉化途徑：通過鰓的呼吸和濾食等轉移到養殖海水中、蓄積到體內各組織，以及通過糞便排出體外等。而阿特拉津在凈化海水中的質量濃度遠高于其在糞便中，說明主要消除途徑可能為鰓的接觸過濾作用。

圖4 空白水樣與暴露水樣（a）及太平洋牡蠣糞便（b）中阿特拉津含量的變化比較Fig.4 Comparison of atrazine contents in blank water samples,exposed water samples (a) and feces (b) of C.gigas

3 結 論

研究結果表明，阿特拉津在太平洋牡蠣中的生物富集具有明顯的組織差異性，內臟團和鰓的富集能力大于外套膜、性腺和閉殼肌，其中閉殼肌中含量最低，內臟團為其主要的蓄積靶組織。阿特拉津在太平洋牡蠣體內的生物富集能力與環境濃度相關，濃度越低富集能力越強。在凈化階段，太平洋牡蠣中阿特拉津的含量隨凈化時間呈指數下降，且暴露質量濃度越高，太平洋牡蠣對阿特拉津的排出速率越快，主要消除途徑可能為鰓的接觸過濾作用。盡管太平洋牡蠣對阿特拉津的消除能力較強，然而各種風險調查顯示，環境中持續的阿特拉津污染問題較為嚴峻，由此產生的生態和食品安全風險仍需引起重視。