基于孢粉素微膠囊的共包埋、保護及遞送益生菌和乳糖酶的體系

鄧紫玙，丁 一，侯欣堯，李 斌，梁宏閃*

（華中農業大學食品科技學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

全球有超過70%的人口患有不同程度的乳糖不耐癥，該病癥是由于人體內缺乏乳糖酶（-galactosidase，-Gal）所致。-Gal制劑和益生菌制劑均可以有效治療乳糖不耐癥，且它們均不會引起食品質量或營養狀況的改變，因此上述補充劑法是極有前景的治療乳糖不耐癥方法。然而，補充劑中的-Gal和益生菌在加工、運輸、貯存和攝食過程中均會面臨許多不利環境，例如溫度變化、凍干處理、極端pH值和各種消化酶，導致-Gal和益生菌的活性大幅度降低，這將極大地影響這類補充劑的使用效果。為了降低這些不利因素的影響，研究人員已設計多種遞送系統，例如納米顆粒、膠束、乳液、微膠囊和脂質體等，用于保護-Gal制劑和益生菌制劑。盡管相關研究已取得了一些進展，但是依舊存在許多問題，一方面，仍缺乏成本效益高的遞送系統，并且作為食品補充劑，遞送載體需要由食品級成分構成，且具備良好的穩定性以滿足商業應用的需求。另一方面，目前幾乎沒有報道過益生菌和-Gal的共包埋材料，其可以同時提高益生菌和-Gal的胃腸道穩定性、貯存穩定性和熱穩定性。

花粉中提取的孢粉素外壁膠囊（sporopollenin exine capsules，SECs）被認為是一種安全、可食用的天然植物基微膠囊。SECs具有結構形貌均一、內腔大、彈性好、抗物理化學性、紫外線屏蔽能力和抗氧化活性等優點。因此，SECs可以抵抗pH值、離子強度、溫度、光、氧和機械應力的變化。此外，SECs的黏膜黏附特性有助于延長負載物在體內的停留時間，從而提高負載物的生物利用度。綜上，由于SECs具有經濟成本效益和獨特的性質，因此它被認為是口服遞送載體的熱門候選者。但SECs表面存在許多孔洞，這些孔洞就像一把雙刃劍，既為負載物進入SECs提供通道，同時也會導致負載物的泄露。

針對SECs存在的問題，可以利用核殼結構包裹SECs上的孔洞并調節負載物在胃腸道中的釋放行為。常用于構建核殼結構的海藻酸鈣（Ca-alginate，Ca-Alg）凝膠具有pH值響應性，但它在胃腸道中的穩定性較差。研究表明Alg與其他聚合物結合制備的復合凝膠比Ca-Alg凝膠在胃腸道中具有更好的穩定性。之前的研究結果表明：羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachymaran，CMP）是一種益生菌的凍干保護劑，并且具有pH值響應性，因此可以考慮采用Alg與CMP制備復合凝膠構建核殼結構，提高體系凍干穩定性和pH值響應性能力。核殼結構雖然可以解決SECs存在孔洞的問題，但前期研究發現核殼結構不能提高負載物的熱穩定性能，因此可以嘗試采用熱致凝膠對核殼結構進行二次包裹，從而進一步提高負載物的熱穩定性。

本研究設計一種益生菌和-Gal共包埋的遞送體系，該體系以SECs為核，Ca-Alg/CMP凝膠為殼，旨在同時提高益生菌和-Gal的胃腸道、凍干和貯存穩定性；并嘗試使用熱致凝膠對體系進行二次包裹，旨在進一步提高益生菌和-Gal的熱穩定性。本實驗研究核殼結構對益生菌和-Gal的釋放行為、凍干和貯存穩定性的影響，并研究CMP的引入對凝膠殼層形貌、質構和水分分布的影響。最后研究熱致凝膠的二次包埋對益生菌和-Gal熱穩定性的影響，并通過熱致凝膠的微觀結構和流變性能闡明其熱穩定機理，以指導體系在實際生產中應用。本研究旨在提供酶和益生菌制劑共包埋的遞送體系，其可以應用在醫療食品、功能食品或食品補充劑等領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉（alginate，Alg）、羥丙基甲基纖維素（hydroxypropylmethylcellulose，HPMC）、甲基纖維素（methylcellulose，MC） 阿拉丁試劑公司；CMP武漢潤歌生物科技有限公司；向日葵花粉 貝兒蜂蜜有限公司；植物乳桿菌（）CICC 6240 中國工業微生物菌種保藏管理中心；-半乳糖苷酶（-galactosidase，-Gal，250～600 U/mg）上海源葉生物有限公司；二醋酸羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE） 碧云天生物科技有限公司；異硫氰酸酯（isothiocyanate，FITC） 美國Sigma公司；模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）為pH 2.0的HCl溶液，含3.20 mg/mL胃蛋白酶和9.0 mg/mL氯化鈉，模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，含1.60 mg/mL胰蛋白酶。

1.2 儀器與設備

BSA124S-CW電子分析天平 德國Sartorius公司；DNP-9162恒溫培養箱、DZF-6050真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；FE28 pH測定儀 瑞士Mettler Toledo公司；MultskanGo酶標儀 美國Thermo Fisher公司；DF-101S水浴鍋 上海立辰邦西儀器有限公司；DY04-14滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造公司；SU8010掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本日立公司；LSM880激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國Zeiss公司；MesoQMR23-060H低場核磁共振分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；TA-XT Plus質構儀、R2000ex型流變儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 口服遞送體系的制備與表征

1.3.1.1 SECs的制備

按照之前研究工作中所優化的制備方法，提取SECs。簡而言之，將向日葵花粉與磷酸混合，在70 ℃處理5 h，然后依次用水、丙酮、鹽酸和乙醇洗滌。

1.3.1.2 益生菌和-Gal的共包埋

首先將100 mL MRS（De Man, Rogosa and Sharpe）肉湯與100 mg SECs混合，121 ℃滅菌15 min。冷卻后接種1 mL菌株，將混合物在30 ℃培養15 h。然后將過濾得到的SECs與-Gal（2 mg/mL）混合，將混合物置于30 ℃的真空干燥箱中2 h，得到包埋益生菌和-Gal的SECs（SECs-encapsulatedand-Gal，SLG）。

將一部分SLG置于10 mL SIF中，100 r/min、37 ℃恒溫搖床中孵育480 min。然后收集1 mL溶液，采用10 倍稀釋梯度法進行計數，在MRS瓊脂平板上測定溶液中的活菌數。益生菌負載量按式（1）計算：

將另一部分SLG置于12 000 r/min離心4 min獲得游離的-Gal。按照之前研究方法測定-Gal活性。簡而言之，1 mL-Gal（27～95 U）與5 mL 2.5 mg/mL鄰硝基苯--半乳吡喃糖苷溶液混合反應10 min，隨后快速加入2 mL 0.5 mol/L NaCO溶液以終止反應。使用全自動酶標儀在420 nm波長處測定樣品的吸光度。通過酶活力保留率表示-Gal的負載量，如式（2）所示：

1.3.1.3 核殼凝膠的制備

SLG均勻分散在多糖溶液中，該多糖溶液由不同比例的CMP（6 g/100 mL）和Alg（5 g/100 mL）組成。采用擠壓法，用5 mL無菌注射器吸取SECs/多糖混合物逐滴加到CaCl（0.05 mol/L，50 mL）溶液中，將獲得的核殼凝膠用無菌去離子水洗滌。將Ca-Alg包裹的SLG樣品命名為復合凝膠-0。復合凝膠-1、復合凝膠-2和復合凝膠-3代表Ca-Alg/CMP包裹的SLG樣品，其Alg-CMP的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1。

1.3.1.4 微觀結構分析

樣品的圖像在SEM（加速電壓10.0 kV）觀察。將SECs浸入液氮中1 min，使用鋼制手術刀片對其進行切割，用于拍攝SECs的橫截面圖片。

負載菌的SECs置于2 mL無菌生理鹽水中，加入10 μL CFDA-SE染料，然后在4 ℃冰箱中避光放置20 min，將染色后的載菌SECs與FITC標記的-Gal混合（1 mL的-Gal溶液中加入50 μL FITC染料，避光攪拌30 min），將混合物置于30 ℃的真空干燥箱中2 h，得到熒光染色后SLG。樣品在CLSM上拍攝成像。

1.3.2 體外模擬消化實驗

將樣品置于SGF中2 h（恒溫搖床37 ℃、100 r/min），然后轉移至SIF（恒溫搖床37 ℃、100 r/min）進一步釋放。在固定時間點取出1 mL釋放的溶液，測定-Gal活性，并用稀釋分離計數法測定釋放溶液中的活菌數。

1.3.3 復合凝膠殼層的表征

多糖溶液由不同比例的CMP（6 g/100 mL）和Alg（5 g/100 mL）組成，用5 mL注射器吸取多糖溶液，逐滴加到CaCl（0.05 mol/L，50 mL）溶液中，將獲得的凝膠用去離子水洗滌。Ca-Alg凝膠殼層命名為AG，作為對照。ACG-1、ACG-2和ACG-3代表Ca-Alg/CMP凝膠殼層，其Alg-CMP的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1。參考Shang Longchen等的方法，使用低場核磁共振分析成像系統對樣品進行測定，采用低場核磁共振分析儀。將約1 g樣品放入圓柱形玻璃管（直徑15 mm）中，插入核磁共振分析儀中，測定樣品的自旋-自旋弛豫時間。

為測定經過不同pH值處理對復合凝膠硬度的影響，將上述得到的濕凝膠在pH 2.0的HCl溶液和pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中分別浸泡2 h后過濾得到不同pH值處理的樣品。使用TA-XT Plus質構儀測定樣品的硬度，測定條件如下：TPA模式；鋁質圓柱形探頭（P/36R）；測試觸發力1 g；形變壓縮率50%；測前速率1 mm/s；測試速率1 mm/s；測后速率1 mm/s。

采用SEM觀察復合凝膠殼層的微觀結構。

1.3.4 貯存穩定性

在4 ℃和25 ℃條件下，探究樣品貯存穩定性。貯存30 d后，測定樣品菌數和酶活力損失率，如式（3）、（4）所示：

1.3.5 熱穩定性

1.3.5.1 熱保護體系的制備

1 g復合凝膠-2分別加入5 mL的HPMC（10 g/100 mL）、MC（10 g/100 mL）和蛋清。濕樣混合物分別在45、55、65 ℃熱處理30 min和80 ℃熱處理1 min，測定樣品的菌數和酶活力損失率。

1.3.5.2 熱致凝膠的表征

使用AR2000ex型流變儀對樣品進行測試，在1 Hz下進行動態應變掃描測定，以確定在25 ℃時應變范圍為0.01%～100%的線性黏彈性范圍。然后，在25 ℃以0.2%的恒定應變進行0.1～100 rad/s的動態掃頻。探究不同溫度和時間對樣品的黏彈特性的影響，測試溫度和時間分別為45 ℃（30 min）、55 ℃（30 min）、65 ℃（30 min）和80 ℃（1 min）。添加樣品后，在平板間隙添加甲基硅油防止水分蒸發。

1.4 數據分析

所有實驗重復3 次以上，使用SPSS 22.0統計軟件分析所有測定結果，利用Origin 2020作圖。

2 結果與分析

2.1 口服遞送體系的表征

2.1.1 SECs的表征

將脫脂向日葵花粉（defatted sunflower pollen，DSPs）和酸解向日葵花粉（SECs）進行對比分析。由圖1 SEM圖像可知，DSPs和SECs具有相似的表觀形貌，但SECs表面上存在的孔洞數量比DSPs表面存在的孔洞數量多，這可能是由于酸解處理進一步去除了附著在孔洞上的蛋白質等物質，從而使更多的孔洞暴露出來。SEM橫截面圖表明，DSPs內腔中含有胞內物質而SECs內腔干凈，證明酸解處理成功去除花粉的胞內物質。該結果與CLSM圖像結果一致：DSPs內腔中觀察到由于胞內物質產生的自發熒光，但SECs內腔中沒有觀察到熒光。綜上SECs具有多孔結構和干凈的空腔，可為所負載的物質提供更大的空間。

圖1 脫脂、提取和益生菌-β-Gal負載后SECs的SEM和CLSM圖Fig.1 CLSM and SEM images of defatted, acid-hydrolyzed, and L.plantarum-β-Gal-loaded SECs

2.1.2 益生菌和-Gal的共包埋

由SEM圖像（圖1）可知，負載后大量富集在SECs內部；采用FITC標記-Gal、CFDA-SE標記，由CLSM圖像可知，SLG內觀察到桿狀益生菌的熒光和綠色熒光背景，進一步證實了和-Gal 成功封裝到SECs中。負載處理后，益生菌負載量達到9.63h10CFU/g，酶活力保留率達到80.72%。研究結果表明，SECs可以為和-Gal提供良好的生物相容性環境，這可能歸因于SECs具有空腔和親水性，可以將足夠的MRS培養基吸收到空腔中以供給生存所需的營養，利于益生菌的代謝和增殖。值得注意的是，和-Gal可以共存，的存在不會影響-Gal的活性。此外，SEM圖表明負載前后SECs具有相似的形貌和結構，這對于封裝系統的工業應用非常重要。

2.1.3 復合凝膠殼層表征

盡管和-Gal成功負載到SECs中，但SECs表面存在孔洞，則無法避免負載物泄漏。采用復合凝膠（Ca-Alg/CMP）作為外殼包裹SECs的孔洞以防止和-Gal泄漏。圖2顯示，復合凝膠-0可以完全覆蓋SECs表面納米級的小孔和部分覆蓋微米級的大孔，而復合凝膠-1、復合凝膠-2和復合凝膠-3均可完全覆蓋所有孔洞。

圖2 包裹復合凝膠涂層SECs的SEMFig.2 SEM images of SECs coated with Ca-Alg or Ca-Alg/CMP systems

2.2 體外釋放行為

對比研究不同樣品在模擬胃腸條件中的釋放行為。負載的SECs（即沒有形成凝膠的樣品）和負載的Ca-Alg（其不含SECs）作為對照組。不同樣品的體外釋放曲線見圖3。在模擬胃腸條件中，SECs體系中的釋放量一直為0 CFU/mL。對于Ca-Alg體系，在SIF中處理5 min，的釋放量大幅度增加，達到2.07h10CFU/mL，在60 min達到峰值，約為6.72h10CFU/mL；然而，復合凝膠-0體系在SIF中5 min，釋放量約為1.92h10CFU/mL，在120 min達到峰值，約為7.42h10CFU/mL。與復合凝膠-0體系相比，復合凝膠-1、復合凝膠-2和復合凝膠-3體系在SIF中處理5 min，釋放量均低于10CFU/mL，隨處理時間的延長，釋放量逐漸增加并在第480分鐘達到最大值，分別為8.60h10、9.61h10CFU/mL和7.87h10CFU/mL。由圖3b可知，在模擬胃腸條件下，SECs體系中-Gal累積釋放率一直為0%。Ca-Alg體系在SIF中處理5 min，-Gal的累積釋放率約為7%，在第60分鐘達到峰值，約為8%；然而，復合凝膠-0體系，在SIF中處理5 min，-Gal的累積釋放率約為5%，在第240分鐘達到峰值，約為15%。相比之下，復合凝膠-1、復合凝膠-2和復合凝膠-3體系中-Gal的累積釋放率隨處理時間的延長而增加，在第480分鐘達到最大值，分別為58.26%、61.67%和54.62%。

圖3 不同體系中L.plantarum（a）和β-Gal（b）的體外消化模擬釋放曲線Fig.3 In vitro release profiles of L.plantarum (a) and β-Gal (b) from different systems

對于SECs體系，由于SECs表面存在孔洞，使和-Gal在SGF中暴露，從而導致益生菌細胞的死亡和-Gal失去活性。與Ca-Alg體系相比，復合凝膠-0系統具有可持續的釋放能力，這可能是由于復合凝膠-0中形成了核殼結構，因此負載物質需要更長的時間才能從核殼結構中釋放出來。此外，復合凝膠-2比復合凝膠-0不僅具有更好的緩釋能力，而且和-Gal均表現出更大的釋放量，表明CMP的加入可提高體系的pH值響應特性，從而增強體系在SGF中的穩定性。CMP與Ca結合具有pH值響應特性在之前的研究中已經報道。

圖4顯示，在SGF處理后，復合凝膠-0系統只能包裹SECs上的部分孔洞；而復合凝膠-1、復合凝膠-2和復合凝膠-3均包裹SECs上的全部孔洞，表明CMP的引入可以增強系統的抗消化酶性能。SIF處理后，所有樣品的殼層都完全溶解，SECs表面孔洞均暴露。此結果與釋放研究結果一致，證實該系統可以實現和-Gal的靶向遞送和持續釋放。

圖4 不同樣品SGF孵育2 h（a）和SGF孵育2 h后SIF孵育8 h（b）的SEM圖Fig.4 SEM images of different samples incubated for 2 h in SGF (a),2 h in SGF and 8 h in SIF (b)

2.3 復合凝膠殼層的表征

2.3.1 低場核磁與微觀結構分析

復合凝膠中不同組分水分子的遷移率和比例是反映凝膠特性的重要指標，通過低場核磁共振技術測定復合凝膠中不同狀態的水分分布，結果如圖5所示。、和代表峰頂點時間，表征該相態水的分子運動性，峰頂點時間越大，則表示該相態水的運動性越強，被束縛的程度越弱，復合凝膠中結合水、不易流動水和自由水可分別用、和表示。一般而言反映與大分子緊密結合的水，反映凝膠結構內的水，對應凝膠結構外的水。、和是相應的峰比例分數，表征該相態水占該樣品總水分的含量，峰比例分數越大，表示該相態水占比越多。

圖5 不同樣品的T2圖譜（a）、不同相態水的分布比例（b）和SEM圖像（c）Fig.5 T2 relaxation time spectra of different samples (a), proportion of water distribution in different samples (b), and low-field nuclear magnetic resonance and SEM images of different samples (c)

由圖5a可知，所有樣品均為信號幅度最大，其次是、的信號幅度最小。與AG相比，ACG中的信號幅度增加，的信號幅度減少；其中ACG-2的的信號幅度最大，的信號幅度最小；該研究結果表明CMP的引入可以改變凝膠中不同狀態的水分分布強度。由圖5b可知，所有樣品均為值最大，其次、值最小。與AG相比，ACG中值增加，值減少；其中ACG-2的值最大，值最小。值降低表明CMP的引入導致ACG對水結合能力增強，更多的自由水轉化為不易流動水，表明ACG的凝膠網絡狀結構比AG更加致密，可以包裹更多的水分子。圖5c不同顏色表示不同的流動態氫質子密度，紅色代表流動態氫質子分布更密集，其流動態水更多，為高水分含量的區域，藍色表示低水分含量的區域。紅色區域在AG凝膠中占比較ACG大，說明AG凝膠中流動態水更多，與峰比例分布圖結果一致。

由圖5c SEM可知，ACG平均孔徑小于AG，因此ACG的空間網絡狀結構比AG更加致密；隨著復合凝膠中CMP含量的增加，平均孔徑呈現減小趨勢，相應凝膠空間網絡狀結構更加緊湊。此結果與低場核磁測定結果一致。結果表明復合凝膠中CMP含量可以通過影響凝膠中的水分分布情況，調節凝膠殼層的微觀結構，這可能歸因于CMP的加入不僅可以和Ca通過配位鍵結合，也可以與Alg 之間形成氫鍵，從而使聚合物鏈彼此更加接近，減小了凝膠孔徑，形成更致密的空間網絡狀結構。值得注意的是，凝膠的微觀結構對其釋放行為有顯著影響（圖3），因為更緊密的凝膠網絡狀結構不僅可以作為屏障減少和-Gal直接暴露于SGF，還有助于減慢和-Gal在SIF的釋放速率。

2.3.2 硬度與微觀結構分析

由圖6a可知，不同處理后，所有樣品硬度均表現出相同的變化趨勢，與未處理的樣品相比，經過酸處理后，樣品的硬度增加；經過堿處理后，樣品的硬度減少。在未處理和酸處理的條件下，ACG-2的硬度均大于AG，且ACG-2和AG均經過酸處理后硬度顯著增大；而經過堿處理后，硬度顯著減小。由圖6b所示，處理后，所有樣品的空間網絡狀結構均表現出相同的變化趨勢。與未處理的樣品相比，經過酸處理后的樣品的空間網絡狀結構更致密；而經過堿處理的樣品觀察到相反的趨勢。且相比于AG，ACG的空間網絡狀結構更加致密。結果表明復合凝膠具有pH值響應能力，與模擬消化（圖3）實驗結果一致。復合凝膠殼層具有pH值響應性可能是由于酸性條件促進多糖的羧基的質子化從而增強氫鍵相互作用，并且堿性條件下Alg和CMP中羧基之間的靜電排斥作用增強，該特性使復合凝膠殼層適合作為口服遞送材料。

圖6 不同處理凝膠的硬度（a）和SEM圖（b）Fig.6 Hardness (a) and SEM images (b) of different gels with different treatments

2.4 貯存穩定性

貯存穩定性是評判所遞送系統是否適合工業化生產的標準之一，因此探究復合凝膠-2體系經過凍干處理后的貯存穩定性。由表1可知，凍干處理后，純菌液的菌數損失率達到99.31%，純酶液的酶活力損失率達到28.32%，而復合凝膠-2體系中菌數損失率為14.37%、酶活力損失率為0.92%。結果表明復合凝膠-2體系可以提高和-Gal的凍干穩定性，這可能是由于SECs和Ca-Alg/CMP 凝膠之間的協同作用。由圖7可知，對于所有樣品，隨著貯存溫度的升高，菌數和酶活力損失率均增大，這歸因于益生菌細胞在較高溫度下代謝更旺盛和蛋白質在高溫下易變性；對于而言，復合凝膠-2體系可以降低其在4 ℃貯存條件下的菌數損失率（＜0.01）；對于-Gal而言，復合凝膠-2體系可以降低其在25 ℃貯存條件下的酶活力損失率（＜0.01）。結果表明核殼結構的引入可以提高該體系中和-Gal的貯存穩定性。

表1 凍干后樣品中的菌數損失率和酶活力損失率Table 1 Loss rates of viable cell counts and enzyme activity in samples after freeze-drying process

圖7 冷凍干燥后不同樣品中L.plantarum（a）和β-Gal（b）在4 ℃和25 ℃條件下的貯存穩定性Fig.7 Storage stability of L.plantarum and β-Gal in different lyophilized samples at 4 and 25 ℃

2.5 熱穩定性

2.5.1 熱穩定性表征

如圖8所示，總體而言，隨著熱處理溫度的上升，所有樣品中的菌數損失率和酶活力損失率均呈現增大的趨勢。在45 ℃條件下處理30 min后（圖8a），相比于對照組（純菌液）的菌數損失率（95.20%），MC體系的菌數損失率降低了92%，為3.77%。其他體系的菌數損失率分別為12.11%（復合凝膠-2體系）、7.65%（HPMC體系）、12.78%（蛋清體系）；相比于對照組（純酶液）的酶活力損失率（8.89%），其他體系除蛋清體系的酶活力損失率均減小，分別為4.51%（復合凝膠-2體系）、1.20%（MC體系）和2.97%（HPMC體系）。在55 ℃條件下處理30 min后（圖8b），對照組（純菌液）的菌數損失率（98.81%）和復合凝膠-2體系的菌數損失率（97.99%）無顯著差異，而熱致凝膠進行二次包裹后可以降低菌數損失率（＜0.05）；相比于對照組（純酶液）的酶活力損失率（25.91%），其他體系除蛋清體系的酶活力損失率均減小，分別為11.39%（復合凝膠-2體系）、2.41%（MC體系）和2.19%（HPMC體系）。在65 ℃條件下處理30 min（圖8c）和80 ℃條件下處理1 min（圖8d）后，其菌數損失率和酶活力損失率的整體變化趨勢與55 ℃條件下處理30 min的變化趨勢相同。

圖8 不同處理后不同樣品中L.plantarum和β-Gal的熱穩定性Fig.8 Thermal stability of L.plantarum and β-Gal in different samples after different treatments

在不同處理條件下，蛋清體系的酶活力損失率總是接近100%，這可能是由于蛋清中的某種成分與-Gal發生了相互作用，從而破壞-Gal活性，導致其失活。實驗結果表明，熱致凝膠的二次包裹，可以提升和-Gal的熱穩定性，其中MC的熱穩定效果最佳。這可能是由于在加熱條件下，MC形成的凝膠具有更加致密的網絡狀結構，起到隔絕溫度的效果，減小和-Gal所處微環境的溫度變化，從而提升其熱穩定性。

2.5.2 熱致凝膠的表征

HPMC、MC和蛋清是3 種常見的熱致凝膠。為了進一步探索熱致凝膠提升體系熱穩定性的機理，測定了熱致凝膠的黏彈特性，其中2 個重要參數分別為儲能模量（’）與損耗模量（”）。如圖9a所示，當應變較小時，所有樣品的’和”基本保持穩定，直至應變增大到一定程度，所有樣品的’和”突然下降，這表明樣品的結構發生破裂，由線性行為轉變到非線性行為。如圖9b所示，隨著角頻率的增加，所有樣品的’和”值均呈增加趨勢，說明所有樣品都具有頻率依賴性。圖9c～f顯示，在不同的溫度下，MC的’在所有樣品中最大，’值越大代表了較高的凝膠強度和相應更加致密空間網絡狀結構，該結果可以解釋MC具有最佳熱穩定效果的原因。在45 ℃，隨著時間的延長，MC和蛋清”和’迅速增大，然后增速逐漸變緩，最終到達平臺區，且’始終大于”，表明在MC和蛋清凝膠中，彈性行為占主導；而隨著時間的延長，HPMC的”大于’，表現出黏性行為。在55 ℃和65 ℃，隨著時間的延長，所有樣品的’大于”，表明所有樣品均具有彈性行為占主導的凝膠態特性。在80 ℃，隨著時間的延長，MC和HPMC均從黏性行為占主導（”＞’）轉變為彈性行為（”＜’）占主導的凝膠態特性。進一步解釋，在加熱條件下，MC、HPMC和蛋清形成凝膠狀結構，內部結構更加緊湊，該結果與熱穩定性結果一致。由圖10可知，MC和HPMC凝膠均為空間網絡狀結構，蛋清表現為層狀結構；且MC平均孔徑小于HPMC，因此MC的空間網絡狀結構比HPMC的空間網絡狀結構更加致密。該結果與黏彈性的測試結果一致。

圖9 不同樣品的應變掃描（a）、頻率掃描（b）和45、55、65、80 ℃應變掃描（c～f）Fig.9 Strain scan curves (a), frequency scan curves (b), and time scan curves (c, d, e, f) of different samples

圖10 不同樣品的SEM圖像Fig.10 SEM images of different samples

3 結 論

開發了一種用于益生菌和-Gal共包埋、保護和遞送的新型核殼結構載體，不僅可以實現益生菌和-Gal在胃腸道中持續和靶向釋放，還可以同時增強益生菌和-Gal的貯存、凍干和熱穩定性。研究發現，該體系中益生菌的負載量達到9.63h10CFU/g、酶活力保留率達到80.72%。值得注意的是，復合凝膠-2對和-Gal的緩釋能力優于復合凝膠-0，其在模擬胃腸條件中600 min后活細胞數量約為10CFU/mL，酶活力保留率約為62%。相比于純菌液和純酶液，復合凝膠-2體系可以減少凍干后的菌數損失率和酶活力損失率（＜0.05），分別減少84.94%和27.40%。復合凝膠-2體系可以降低4 ℃貯存條件下的菌數損失率（＜0.05）和25 ℃貯存條件下的酶活力損失率（＜0.05），提高該體系中和-Gal的貯存穩定性。此外，在Ca-Alg/CMP殼中，CMP引入可以改變體系對水的結合能力，促進凝膠形成更加致密的空間網絡狀結構；同時其可以提升殼層凝膠的pH值響應能力，進而調節包埋物質在SCG中的釋放行為。最后利用MC的熱致凝膠特性對核殼結構進行二次包埋，可以提高（＜0.05）益生菌和-Gal的熱穩定性，綜上所述，本研究為食品工業中益生菌和酶制劑的共包埋、保護和輸送提供了一種新的思路。進一步的研究可能集中在制劑的感官評價和口服功效的體內評價上。