可同化氮源磷酸氫二銨對發酵型獼猴桃酒品質的影響

盧麗娟，鐘 瑤，秦 義,*

（1.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃富含VC等營養物質，深受消費者喜愛。但是，近些年我國獼猴桃產量顯著增加，新鮮獼猴桃逐漸出現季節性供過于求。同時，獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，不易保存且易腐爛，因此，有必要將其加工成如獼猴桃酒、獼猴桃汁、果醬和果脯等相關產品。隨著我國果酒消費市場的興起，獼猴桃酒也具有了良好的發展前景。但目前獼猴桃酒釀造技術還不成熟，獼猴桃酒還存在高級醇含量高、香氣弱、酸度高等一系列影響果酒品質的問題，亟待解決。

以銨鹽為代表的可同化氮是酵母生長代謝的重要營養因子，酵母在進行果酒發酵時所需要的可同化氮含量與酵母菌株、果汁含糖量、發酵條件等密切相關。對于葡萄酒發酵而言，所需可同化氮的最低質量濃度為140～150 mg/L，適宜可同化氮質量濃度為200～500 mg/L，超過500 mg/L則認為可同化氮含量過量。在包括葡萄酒在內的果酒釀造過程中，根據原料可同化氮水平，在恰當時間內適量補加可同化氮不僅可以保障乙醇發酵的正常進行，也有利于提高果酒發酵香氣中的優良香氣物質的合成，從而提高果酒品質。葡萄汁可同化氮素質量濃度在200～500 mg/L時，隨著可同化氮含量增加，高級醇含量降低。在蘋果酒、篤斯越橘果酒、桑葚果酒以及黃酒中，均發現適量的添加無機氮源，可以有效控制酒中的高級醇含量。此外，可同化氮與果酒發酵香氣的作用關系比較復雜，包括短鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸和其酯類等在內，許多揮發性成分含量受氮素種類和濃度的調控。比如，葡萄汁氮素與發酵香氣中的乙酸乙酯含量正相關。

盡管可同化氮在葡萄酒上的研究較為詳盡，但是可同化氮對發酵型獼猴桃酒品質影響的研究較少。目前對獼猴桃酒的研究主要都集中在獼猴桃品種選擇、獼猴桃釀酒原料的前處理和酵母篩選與應用等。

本研究以陜西主栽品種‘徐香’獼猴桃為原料，以目前普遍選擇且較為便宜的可同化氮源磷酸氫二銨（diammonium phosphate，DAP）為研究對象，系統研究補充DAP對獼猴桃酒發酵進程，以及對獼猴桃品質相關因素，如高級醇、甲醇、氨基酸、VC、總酚、香氣物質等的影響，以期為高品質發酵型獼猴桃酒釀造提供氮源應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘徐香’獼猴桃，采自陜西省楊凌農業高新技術產業示范區，經過自然后熟軟化后用于獼猴桃酒的釀造。獼猴桃初始含糖量118.0 g/L，總酸13.9 g/L（以酒石酸計），pH 3.26。

本土釀酒酵母LFN524活性干粉（釀酒酵母LFN524由西北農林科技大學葡萄酒學院劉延琳教授實驗室保藏；酵母活性干粉由本課題組團隊自制，質量符合GB 31639ü2016《食品加工用酵母》）；果膠酶Lallzyme Ex 法國拉曼公司；DAP、葡萄糖、氫氧化鈉、甘油、3,5-二硝基水楊酸、亞硫酸、抗壞血酸、福林-酚（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；Venusil AA氨基酸分析方法包 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）裝置（配有57330-U聯用手柄、DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30 μm，2 cm）） 美國Supelco公司；QP2020氣相色譜-質譜聯用儀、UV1800紫外分光光度計 日本島津公司；1290高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Y15全自動葡萄酒分析儀 西班牙BioSystems公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃酒發酵條件

發酵容器為1 L玻璃罐，裝入700 mL獼猴桃汁，罐口用發酵栓密封。設置添加100、200、300、400 mg/L（氮質量計，下同）的DAP 4 個實驗組和一個未添加DAP的對照組（0 mg/L），每組設置3 個平行發酵。

1.3.2 發酵工藝流程與操作要點

‘徐香’獼猴桃→打漿取汁→添加二氧化硫→添加果膠酶→成分調整→添加酵母→啟動乙醇發酵→乙醇發酵監控→發酵結束→自然澄清。

原料處理：將自然軟化的‘徐香’獼猴桃，去果皮，果肉稱質量后投入榨汁機打漿；打漿后及時添加60 mg/L的二氧化硫防止氧化和有害微生物的增殖，靜置1 h后添加20 mg/L果膠酶并酶解12 h。

成分調整：添加蔗糖至獼猴桃汁含糖量204 g/L；按照實驗設計，除對照外，于不同發酵罐中分別添加100、200、300、400 mg/L的DAP。

添加酵母：活性酵母干粉添加量200 mg/L，利用1∶1的獼猴桃汁和水混合液于37 ℃進行活化，活化后導入發酵罐并攪拌均勻。

乙醇發酵：發酵溫度為20 ℃，靜置發酵，每隔12 h取樣監測糖的消耗，當殘糖質量濃度在48 h內不再變化時，乙醇發酵結束，并添加60 mg/L的二氧化硫。

1.3.3 理化指標的檢測

殘糖的檢測采用3,5-二硝基水楊酸法；總酸、揮發酸、乙醇體積分數、甲醇、VC等測定參考GB/T 15038ü2006《葡萄酒果酒分析方法》；氨基酸按照Venusil AA氨基酸分析方法按照使用說明書進行檢測；總酚采用福林-酚法測定。

甘油、氨態氮質量濃度和伯胺氮質量濃度，利用Y15全自動葡萄酒分析儀試劑盒測定，可同化氮質量濃度/（mg/L）=伯胺氮質量濃度＋0.82氨態氮質量濃度。可同化氮（氨態氮）利用率為發酵結束時酒已利用可同化氮（氨態氮）含量與獼猴桃汁可同化氮（氨態氮）含量的比值。

檸檬酸的檢測使用Aminex HPX-87H有機酸分析柱（300 mmh7.8 mm）。流動相為0.005 mol/L HSO溶液，流速0.6 mL/min，進樣量5 μL，55 ℃柱溫，檢測波長為210 nm。配制質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的檸檬酸標準品，經過0.22 μm有機膜過濾后進樣，測定得到相應質量濃度的峰面積與出峰時間，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。發酵液按照20～100稀釋倍數進行稀釋測定并計算。

1.3.4 香氣物質分析

獼猴桃酒香氣物質檢測采用頂空SPME結合氣相色譜-質譜聯用法進行定量分析，與馬娜等的方法相同。

SPME樣品處理：取8 mL酒樣和20 μL內標溶液（40 μg/L 2-辛醇）置于20 mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中，加入2.0 g NaCl，啟動攪拌子，在40 ℃水浴中平衡15 min，然后插入萃取纖維，在40 ℃吸附30 min后立即將萃取頭在氣相色譜進樣口230 ℃熱解吸5 min。

氣相色譜-質譜條件：不分流進樣，保持載氣（氦氣）恒定流速1.5 mL/min；柱升溫程序為40 ℃保持5 min，以2 ℃/min上升至130℃，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，總運行時間78 min；進樣口溫度230 ℃，連接桿溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，電子電離源，在70 eV質譜掃描范圍/35～350。

定性定量分析：采用標準品保留時間對比、保留指數對比和NIST 2017質譜譜庫查詢進行香氣化合物定性。采用內標-標準曲線法定量。通過香氣標準品和2-辛醇的相對峰面積建立標準曲線，在0.99以上。將準確定性物質代入標準曲線計算獲得定量結果。

1.4 數據分析

利用SPSS 18.0軟件進行差異顯著性分析，并利用Origin 2021軟件進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 添加DAP對獼猴桃汁中糖和氮源利用的影響

添加不同質量濃度DAP，均可以加速獼猴桃酒起酵后48 h內的糖利用速度，特別是添加300 mg/L DAP時的糖消耗速度最快，這也反映了酵母代謝速度和發酵速度的加快（圖1A）。伴隨著發酵速度的加快，酵母細胞需要消耗更多氮源用于合成細胞代謝相關酶類，從而支撐快速的細胞代謝和增殖。圖1B、C顯示，添加DAP增加了獼猴桃汁可同化氮和氨態氮的利用率。未添加DAP時，氨態氮和可同化氮利用率分別為70.41%和74.85%，而在添加DAP 100、200、300、400 mg/L的條件下，氨態氮的利用率分別為94.50%、97.36%、97.73%和97.86%，可同化氮的利用率分別為80.92%、84.17%、84.00%和86.96%。與本研究結果類似，Chen Dai等在發酵荔枝酒時也發現了添加DAP促進可同化氮利用率增加的現象。

圖1 添加DAP對獼猴桃果汁中的糖和氮源利用的影響Fig.1 Effect of DAP addition on the utilization of sugar and nitrogen in kiwifruit juice

2.2 DAP對獼猴桃酒基本理化指標的影響

由于獼猴桃酒酸度較高，以及隨著乙醇發酵的進行而不斷增高的乙醇體積分數，抑制了發酵末期的酵母代謝活性。因此，在獼猴桃酒的工業大生產中，通常會出現發酵不徹底的現象。本研究也發現，即使外源添加了可同化氮源，在獼猴桃酒發酵結束時，仍然有少量的糖殘留。但同時也發現，隨著DAP添加量的增加，糖的殘留量有減少的趨勢。此外，添加DAP對獼猴桃酒的乙醇體積分數沒有顯著影響。雖然添加DAP對獼猴桃酒中甘油產量也沒有顯著影響，但與對照相比，添加DAP后的獼猴桃酒中甘油含量略有增加（表1）。

表1 獼猴桃酒發酵結束后的基本理化指標Table 1 Physicochemical parameters of fermented kiwifruit wine

與酸相關的獼猴桃酒理化指標如表1所示，檸檬酸作為獼猴桃酒中主要的有機酸之一，其含量不隨DAP添加量的變化而顯著改變；揮發酸是果酒質量的重要指標，總體來看，所有獼猴桃酒的揮發酸含量遠低于我國食品工業協會頒布的T/CNFIA116ü2019《獼猴桃（果/米）酒》團體標準規定值（≤1.1 g/L）。其中，添加DAP 300 mg/L酒樣的揮發酸質量濃度最低，為（0.18f0.1）g/L。類似的，Hernández-Orte等也發現在合成培養基中添加不同濃度的銨均會使揮發酸含量降低。對照組的總酸最高（（15.24f0.27）g/L），DAP添加量200 mg/L和300 mg/L時的總酸含量相對較低，但是對于獼猴桃酒而言，所有酒樣的總酸含量都偏高。雖然適當的酸含量可以支撐酒體，使酒的口感清爽醇厚，但酸含量過高卻會使酒體失去平衡，口感過硬和尖銳。

2.3 添加DAP對獼猴桃酒中潛在有害醇類物質產量的影響

盡管高級醇和甲醇對獼猴桃酒的風味有貢獻，但是甲醇和高級醇含量過高，以及攝入過量會對人體健康構成威脅，是果酒中潛在的有害醇類物質，因此，在釀造過程中對甲醇和高級醇含量進行調控，對提升果酒的品質和安全性具有重要意義。

2.3.1 獼猴桃酒中的甲醇產量

果酒在釀造過程中，由于水果的果膠分解和酵母甘氨酸代謝，極易產生一定量的甲醇。由圖2可以看出，在獼猴桃汁中添加DAP均可以顯著降低獼猴桃酒的甲醇含量，其中，添加DAP 300 mg/L時獼猴桃酒中的甲醇產量最低，為（345.53f14.48）mg/L，比對照組降低了20.1%（圖2）。在本研究中，不同DAP處理之間的獼猴桃汁相同，因此甲醇含量降低的原因可能是由于外源添加的速效氮源影響了酵母的甘氨酸代謝。

圖2 添加DAP對獼猴桃酒中甲醇產量的影響Fig.2 Effect of DAP addition on the methanol yield in kiwifruit wine

目前，我國尚未出臺獼猴桃酒國家標準，也沒有對獼猴桃酒中甲醇含量作出規定，企業通常參照GB 15037ü2006《葡萄酒》標準執行。GB 15037ü2006規定，紅葡萄酒中甲醇質量濃度不大于400 mg/L，白、桃紅葡萄酒中甲醇質量濃度不大于250 mg/L。在2020年，浙江省品牌建設聯合會發布了T/ZZB1557ü2020《獼猴桃釀造酒》團體標準，規定獼猴桃酒的甲醇質量濃度應不大于1.5 g/L。

2.3.2 獼猴桃酒中的高級醇產量

高級醇是釀酒酵母在果酒釀造過程中產生的主要代謝副產物之一。適量高級醇不僅帶來醇甜的口感，還能與酒中的酸發生酯化反應生成酯類物質，從而對果酒風味形成起重要作用。但含量過高會給酒帶來辛辣、腐臭等令人不愉快的味道，以及會引起飲用者神經系統充血和劇烈頭痛（俗稱“上頭”）等不適感。盡管高級醇在獼猴桃酒中沒有限量要求，但研究認為高級醇總量低于300 mg/L時，可增加葡萄酒香氣的復雜性，而質量濃度超過400 mg/L，就會對酒的感官產生不良影響。

果酒中高級醇的產生與發酵基質中的可同化氮含量和種類、發酵溫度、溶氧量等多種發酵環境和工藝條件有關。本研究用添加可同化氮DAP的方式調控獼猴桃酒的高級醇含量。在發酵結束后的獼猴桃酒中共檢測到正丙醇、正丁醇、異丁醇、1-戊醇、異戊醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、正庚醇、正辛醇和苯甲醇10 種高級醇。其中，異戊醇、異丁醇和正丙醇含量相對較高，其他7 種高級醇含量較低。

不同DAP添加量發酵的獼猴桃酒中總高級醇產量具有顯著差異（圖3）。與對照組相比較，DAP 300 mg/L的總高級醇產量最低（（226.47f16.62）mg/L），下降了42.84%，其中異戊醇和異丁醇分別降低41.38%和58.99%；添加DAP 100、200 mg/L和400 mg/L時，獼猴桃酒總高級醇含量分別下降15.94%、34.43%和38.00%。因此本研究結果表明，在發酵開始前添加適量DAP可以有效降低獼猴桃酒中的總高級醇產量。多個相關研究也顯示，當發酵醪液中的可同化氮含量適宜時，酒中高級醇產量與發酵起始氮源濃度呈負相關。Torrea等向初始可同化氮為160 mg/L的葡萄汁中添加DAP和氨基酸混合物至480 mg/L，以及Vilanova等向初始可同化氮為250 mg/L的葡萄汁中添加DAP至450 mg/L，發酵結束后的酒中高級醇產量顯著降低。

圖3 添加DAP對獼猴桃酒中高級醇含量的影響Fig.3 Effect of DAP addition on the content of higher alcohols in kiwifruit wine

2.4 添加DAP對獼猴桃酒營養組分的影響

2.4.1 獼猴桃酒中的VC含量

本研究使用的‘徐香’獼猴桃，VC質量濃度高達546.72 mg/L。經過乙醇發酵后，對照組和添加DAP組的VC含量均降低，分別下降了27.91%、28.64%、32.75%、30.58%和32.27%，但是不同DAP添加水平和對照組之間的VC含量并沒有顯著差異（圖4），這說明添加DAP并不會加速獼猴桃酒中VC顯著降解。在獼猴桃加工成果酒、果汁、果脯、果干的過程中VC均會發生降解，但是獼猴桃酒能保留更多的VC。

圖4 添加DAP對獼猴桃酒VC含量的影響Fig.4 Effect of DAP addition on VC content in kiwifruit wine

2.4.2 獼猴桃酒中的總酚含量

酚類物質也是獼猴桃酒的重要營養物質之一。添加DAP 100、200 mg/L發酵的獼猴桃酒中總酚質量濃度相對較低，分別為（6.88f0.13）、（7.18f0.15）mg/L，而添加300 mg/L DAP時的總酚質量濃度最高（（9.72f1.4）mg/L）。但是總體來看，DAP添加并沒有極顯著改變獼猴桃酒中的總酚含量（圖5）。

圖5 添加DAP對獼猴桃酒總酚含量的影響Fig.5 Effect of DAP addition on total phenol content of kiwifruit wine

2.4.3 獼猴桃酒中的氨基酸含量

在獼猴桃酒中僅檢測出了組氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸5 種氨基酸（表2），其他氨基酸含量低于檢出限。在被檢出的5 種氨基酸中，組氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和異亮氨酸含量相對較高，而亮氨酸含量較低。通常認為，當氨態氮和氨基酸共存在時，酵母通常會優先利用氨態氮，從而使得氨基酸殘留量增加。但是本研究數據卻顯示，添加DAP提高了獼猴桃汁中的氨基酸利用率（表2）。針對上述現象，還需要通過對獼猴桃成分的細致分析，并利用組學技術等手段進行更深入的機制解析。

表2 添加DAP對獼猴桃酒中氨基酸含量的影響Table 2 Effect of DAP addition on the amino acid content of kiwifruit wine

2.5 添加DAP對獼猴桃酒香氣物質的影響

利用氣相色譜-質譜對不同添加量DAP發酵的獼猴桃酒香氣物質進行檢測，共檢測到52 種香氣物質（圖6）。DAP的添加明顯改變了獼猴桃酒的揮發物質含量，特別是添加DAP 300 mg/L和400 mg/L時。

圖6 獼猴桃酒香氣物質聚類熱圖Fig.6 Cluster heat map of aroma substances in kiwifruit wine

在所檢測到的52 種香氣物質中，有9 種揮發性物質的含量超過其嗅覺閾值（OAV＞1），8 種揮發性物質的OAV在0.1～1之間（表3）。如表3所示，添加DAP顯著增加了乙酸酯類物質和乙酯類物質的含量，其中，乙酸乙酯含量增加顯著，分別增加了45.2%、55.6%、49.6%和26.7%。添加100、300、400 mg/L DAP顯著提高具有花香和果香特征的正己酸乙酯含量。但同時，DAP的添加顯著降低了具有甜蜜香味特征的乙酸苯乙酯的含量，特別是當DAP添加量為300 mg/L時，乙酸苯乙酯含量降低了56.6%。此外，丁酸乙酯被認為是形成獼猴桃香氣輪廓的重要物質，但是經過乙醇發酵后，獼猴桃酒中的丁酸乙酯含量較低，其OAV小于0.1。醛酮類物質的感官特征主要表現為柑橘、玫瑰、檸檬、花香等香味，其中辛醛和癸醛具有較低的嗅覺域值，被認為是獼猴桃的關鍵香氣物質。在獼猴桃酒中共檢測到4 種醛酮類化合物，并且當DAP添加量為300 mg/L時的醛酮類物質總量最高（94.69 μg/L），特別是正辛醛增加了209.2%。高級醇是果酒中重要的呈味物質和芳香物質，一般認為葡萄酒中高級醇低于300 mg/L時可使葡萄酒產生愉快的香味，一旦超過400 mg/L時就會使葡萄酒產生苦味和辛辣感，刺激味加重，使酒的香氣變得粗糙。未添加DAP的獼猴桃酒高級醇接近400 mg/L，添加DAP顯著降低了高級醇總量，以及異戊醇和異丁醇的含量，但同時，添加300 mg/L DAP時，庚醇和1-辛烯-3-醇的含量顯著增加。趙玉等認為1-辛烯-3-醇是獼猴桃的關鍵香氣組分，具有典型的蘑菇氣味。正庚醇具有芳香氣味、可可氣味等，也被認為是蘋果的重要組分。

表3 添加DAP對獼猴桃酒香氣物質的影響（x s）Table 3 Effect of DAP addition on volatile compounds contents in kiwifruit wine (x± s)

為了進一步判別添加不同添加量DAP發酵的獼猴桃酒之間的香氣成分差異，選用OAV高于0.1的17 種香氣物質進行主成分分析（principal component analysis，PCA）（圖7）。前兩個PC解釋了總方差的82.4%，分別為52.2%和30.2%。由圖7可以看出，添加300 mg/L DAP的酒樣位于PC1和PC2的正向端，周圍發酵香氣物質豐富，與庚醇、正己酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸己酯等靠近，說明在發酵起始階段添加DAP 300 mg/L有助于獼猴桃酒發酵香氣的提升。而對照組酒樣位于PC1和PC2的負向端，主要與異戊醇、異丁醇等高級醇和品種香氣物質乙酸苯乙酯靠近。

圖7 前兩個PC處理酒樣的活性香氣物質（OAV＞0.1）的載荷及樣品分布圖Fig.7 PCA loading plot of PC1 versus PC2 for volatile substances(OAV > 0.1) in kiwifruit wine and distribution of kiwifruit wine samples

整體看，添加DAP 100 mg/L發酵的獼猴桃酒脂肪酸含量偏高，會帶來輕微的酸腐味；DAP 200、400 mg/L發酵的獼猴桃酒主要呈現玫瑰和木香香氣；DAP 300 mg/L發酵的獼猴桃酒中酯類含量較高，高級醇產量低，脂肪酸含量相對較低，果香和花香較為濃郁。

3 結 論

在獼猴桃酒乙醇發酵前，向獼猴桃汁中添加適量可同化氮源DAP，有利于獼猴桃酒品質的提升。

添加DAP增加了獼猴桃汁中可同化氮和氨態氮的利用率，加快了獼猴桃酒的乙醇發酵速度。乙醇發酵前補加300 mg/L DAP使獼猴桃酒揮發酸質量濃度降低到（0.18f0.1）g/L。同樣，添加DAP可以顯著降低獼猴桃酒中高級醇和甲醇等潛在有害醇類物質產量，其中，DAP 300 mg/L時的總高級醇產量下降了42.84%，甲醇產量降低了20.1%。而對于獼猴桃酒中的部分營養物質而言，補加DAP沒有顯著改變獼猴桃酒中的VC和總酚含量，但是卻顯著降低了獼猴桃酒中的氨基酸總量。

DAP的添加明顯改變了獼猴桃酒的揮發性物質含量。在獼猴桃酒香氣物質中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、1-戊醇、異戊醇、庚醇、正辛醛和壬醛9 種香氣物質含量超過嗅覺閾值（OAV＞1）。其中，當DAP添加量為300 mg/L可以顯著增加乙酸乙酯、正己酸乙酯、正辛醛、庚醇和1-辛烯-3-醇等香氣物質含量，從而使獼猴桃酒果香和花香較為濃郁。

綜上，在獼猴桃酒發酵前添加適量的可同化氮源DAP，可以有效降低高級醇和甲醇等潛在有害醇類物質產量，同時增加獼猴桃酒的香氣物質含量，從而有利于獼猴桃酒的品質提升。