陜西省典型冷凍食品中大腸桿菌的分子特征及耐藥性檢測

徐 旭，楊 靜，張鵬飛，張鈺嘉，阮傅倩，王 婷，李 雯，萬陽麗，常冠紅，張 瑤，王 新,*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌質量技術檢測檢驗所，陜西 楊凌 712100；3.西北農林科技大學創新實驗學院，陜西 楊凌 712100；4.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

大腸桿菌是人和溫血動物腸道中的共生菌群，屬于條件致病菌，少數獲得特殊毒力因子的大腸桿菌可引起人畜患病。致病性大腸桿菌攜帶毒力因子眾多，如血清抗性蛋白iss、外膜蛋白、耐熱腸毒素、黏附相關蛋白等。這些毒力因子是大腸桿菌引起人類食源性疾病的主要原因，能導致腸外感染（尿路感染、各種腹內、肺部、皮膚和軟組織感染等）或腸道疾病（各種形式的腹瀉，包括溶血性和尿毒癥綜合征）。根據它們的毒力因子和引起的臨床癥狀，將其區分為腸外致病性大腸桿菌（extraintestinal pathogenic，ExPEC）和致瀉性大腸桿菌（diarrheagenic，DEC），DEC根據感染癥狀進一步劃分以下5 類：腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic，EPEC）、腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic，EHEC）、腸產毒性大腸桿菌（enterotoxigenic，ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（enteric invasive，EIEC）和腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative，EAEC）。食用被致病大腸桿菌污染的食物可導致食源性疾病的發生。2008ü2015年、2017年，我國衛生健康委員會歷年發布的《全國食物中毒事件情況的通報》中，由大腸桿菌引發的食物中毒事件占微生物食物中毒事件總數的5%～11%。

細菌耐藥性已成為威脅全球動物和公共衛生的一個重大問題。大腸桿菌的耐藥性逐年上升，在世界衛生組織所描述的12 種抗生素耐藥“優先病原體”名單中，目前排名第3。世界各地已發現對-內酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑和四環素類具有高耐藥水平的大腸桿菌的流行，對人類醫學和獸醫學都構成了潛在的高風險。此外，大腸桿菌獲得抗生素耐藥性的基因庫增加，并且已被證明可以在不同細菌物種、宿主和環境中進行交換，耐藥基因能夠進行水平和垂直傳播。已有報道表明耐藥大腸桿菌可通過直接或間接接觸（如食用受污染的食物和水）從環境傳播給人類。

隨著人們生活節奏的加快，冷凍食品因其方便快捷的優點受到廣大消費者的青睞。冷凍保藏能夠一定程度抑制微生物的生長繁殖，但冷凍食品并非絕對安全，許多病原微生物在冷凍條件下保持代謝活性和致病能力，如在低溫條件下，大腸桿菌可長期處于亞致死狀態，待條件恢復適宜后能夠進行細胞修復并大量繁殖。我國已出現冰淇淋、速凍食品中大腸菌群超標的先例，比利時也報道了由冰淇淋中大腸桿菌引發的感染事件。目前，關于冷凍食品中大腸桿菌的流行及菌株分子特征及抗菌素耐藥性情況的信息有限。因此，本實驗對陜西地區冷凍食品（速凍水餃和冰淇淋）進行采樣調查，分析大腸桿菌的污染、毒力基因、耐藥性及種群分型情況，旨在為有效控制冷凍食品中大腸桿菌的污染提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

緩沖蛋白胨水、麥康凱瓊脂、LB（Luria-Bertani）瓊脂培養基、LB肉湯培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（培養基、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養基 北京陸橋技術有限責任公司；所用15 種抗生素 北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）所用2hMaster Mix、DNA Marker DL2000 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

VD-850型桌上式潔凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；T100型梯度PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像系統美國Bio-Rad公司；GNP-9080隔水式恒溫培養箱、DHG-9132A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物技術有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DH-11L無菌拍打均質機 寧波洛尚智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理

2011年8 月—2015年9月，于陜西省4 市（寶雞、咸陽、西安和渭南）采集典型冷凍食品樣本，共360 份，其中速凍水餃120 份和冰淇淋240 份。速凍水餃和冰淇淋均在－20 ℃冷藏銷售。所有樣本在低溫條件下運送至本實驗室，并在4 h內進行處理。具體采樣信息見表1。

表1 冷凍食品采集地點、類型和數量Table 1 Sample collection locations, types and quantities

樣本處理具體操作如下：按料液比1∶10（g/mL），將3 個速凍水餃（17 g/個）和完整冰淇淋（70 g/個）樣本分別于450 mL和630 mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質機拍打制成樣品勻漿。為防止在樣本處理時造成交叉污染，每更換一次樣本更換一雙滅菌筷。

1.3.2 大腸菌群計數、大腸桿菌分離及鑒定

大腸菌群的計數參照GB 4789.3ü2010《食品微生物檢驗 大腸菌群計數》進行。每個樣本挑取2 個大腸菌群鑒定為陽性的菌落至LB平板活化，并通過PCR擴增大腸桿菌管家基因作進一步鑒定，并將鑒定為陽性的菌株于－80 ℃冰箱中保存，備用。每個樣本隨機挑選1 株分離株進行耐藥、毒力和種群分型實驗。

1.3.3 DNA模板制備

采用煮沸法提取細菌基因組DNA模板。具體操作方法如下：將分離得到的大腸桿菌接種于LB瓊脂培養基，37 ℃培養16～18 h。挑取2～3 個菌落至500 μL ddHO中，100 ℃加熱20 min，12 000h離心3 min，吸取400 μL上清液于另一無菌EP管，即為DNA模板。所有模板保存于－20 ℃冰箱，備用。

1.3.4 毒力基因及耐藥基因檢測

采用PCR技術對大腸桿菌分離株21 種毒素基因和23 種耐藥基因進行檢測。其中21 種毒素基因包括12 種ExPEC相關毒力基因（、、、、、、、、、、、）、1 種EPEC毒力基因（）、1 種EIEC毒力基因（）、1 種EAEC毒力基因（）、2 種EHEC毒力基因（、）、4 種ETEC毒力基因（、、、）；23 種耐藥基因包括：四環素耐藥基因（、、）、磺胺類耐藥基因（、、）、-內酰胺類耐藥基因（、、）、喹諾酮類耐藥基因（、、、、）、多黏菌素耐藥基因（、）、氯霉素類耐藥基因（）以及氨基糖苷類耐藥基因（、、、、、、’VI）。

1.3.5 藥敏實驗

參照美國臨床和實驗室標準協會推薦的瓊脂稀釋法，對49 株大腸桿菌分離株進行15 種抗生素的藥敏實驗。多黏菌素B的耐藥判斷根據歐盟藥敏試驗標準委員會標準進行。15 種抗生素及其耐藥折點見表2。

表2 藥敏測定用抗生素及耐藥折點Table 2 Resistance breakpoints for antibiotics

表3 四重基因型劃分大腸桿菌系統發育群Table 3 Quadruplex genotypes for assigning E.coli isolates to phylo-groups

1.4 數據統計及分析

所有數據使用Microsoft Excel 2016軟件進行統計整理，其中大腸菌群計數結果為同一稀釋度下兩次平行計數的均值，菌株耐藥表型檢測為3 個平行中至少2 個平行一致的結果。繪圖工具使用Origin 2021軟件（OriginLab公司）。使用SPSS 18.0軟件檢驗進行不同樣品類別、地區、包裝方式及月份之間的大腸桿菌檢出結果的差異顯著性分析，＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌檢出、計數結果

如表4所示，360 份冷凍食品中49 份檢測為大腸桿菌陽性（13.6%，49/360），包括速凍水餃樣本42 份（35.0%，42/120）和冰淇淋樣本7 份（2.9%，7/240）。42 份速凍水餃陽性樣本中，大腸菌群數小于10 CFU/g有25 份（20.8%），大腸菌群數為10～100 CFU/g有12 份（10.0%）和大腸菌群數大于100 CFU/g有5 份（4.2%）。7 份冰淇淋陽性樣本中，大腸菌群數小于10 CFU/g有5 份（2.1%）和大腸菌群數為10～100 CFU/g有2 份（0.8%）。此外，速凍水餃大腸桿菌陽性樣本數顯著高于冰淇淋樣本（＜0.05）。

表4 冷凍食品中分離的大腸桿菌流行情況及大腸菌群計數Table 4 Prevalence of E.coli and coliform counts in frozen foods

如表5所示，4 市速凍水餃樣品大腸桿菌污染較為嚴重，受污染最高的地區為西安市（43.3%，13/30），其次為咸陽市（40.0%，12/30）、寶雞市（33.3%，10/30）和渭南市（23.3%，7/30）。按照不同餡料進行分類，速凍水餃中大腸桿菌污染率最高的為肉餡水餃（包括羊肉和豬肉）（36.2%，34/94）、其次是海鮮餡（33.3%，4/12）和蔬菜餡水餃（28.6%，4/14）。此外，對不同采樣地點及不同餡料速凍水餃陽性樣本數進行統計分析，速凍水餃大腸桿菌陽性樣本數不存在顯著差異（＞0.05）。

表5 速凍水餃中大腸桿菌流行情況Table 5 Prevalence of E.coli isolated from quick-frozen dumplings

如表6所示，冰淇淋樣本中大腸桿菌檢出率較低，其中咸陽市和西安市檢出最高，均為3.8%（3/79），其次為寶雞市（1.2%，1/82）。對不同采樣地區便利店和超市進行分類，便利店大腸桿菌的檢出率（5.2%，6/116）高于超市（0.8%，1/124）。對不同包裝方式進行分類，袋裝冰淇淋樣本的大腸桿菌檢出率（3.2%，5/156）高于盒裝樣本（2.4%，2/84）。對采集月份進行分類，7月份樣品（6.7%，4/60）中大腸桿菌檢出率高于6月份樣品（5.1%，3/59），8月和9月采集樣本中沒有分離到大腸桿菌。對不同采樣地點、超市規模、包裝方式和采集月份冰淇淋大腸桿菌檢出陽性樣本數進行統計分析，超市規模對冰淇淋中大腸桿菌污染影響顯著（＜0.05），其余分類中冰淇淋大腸桿菌陽性樣本數不存在顯著差異（＞0.05）。

表6 不同包裝方式和月份的便利店和超市冰淇淋中大腸桿菌的流行率Table 6 Prevalence of E.coli in ice cream sold at retail stores and supermarkets, in ice cream packaged with different packaging methods and in ice cream collected in different months

2.2 毒力基因檢出結果

如表7所示，對49 株大腸桿菌進行21 種毒力基因檢測，共9 種毒力基因被檢出，包括7 種ExPEC相關毒力基因（、、、、、和）、2 種DEC毒力基因（和）。其中基因和的檢出率最高為14.3%，其次是（12.2%）、（10.2%）、（8.2%）、（4.1%）、（4.1%），和的檢出率均為2.0%。根據和這兩種特異性基因，DEC菌株被分為以下兩類：EPEC（=4）和EIEC（=2）。

表7 大腸桿菌分離株毒力基因檢出結果Table 7 Results of detection of virulence genes of E.coli

續表7

2.3 耐藥實驗結果

如表8所示，49 株大腸桿菌分離株對阿莫西林/克拉維酸鉀和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（98.0%，48/49）耐藥最為普遍，其次為四環素（20.4%，10/49）、氨芐西林（16.3%，8/49）和氯霉素（8.2%，4/49），對慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、頭孢曲松、頭孢噻污、頭孢哌酮、頭孢他啶的耐藥率較低（2.0%，1/49）。此外，受試菌株對頭孢西丁和多黏菌素敏感。

表8 不同冷凍食品中大腸桿菌分離株耐藥情況Table 8 Resistance rates of E.coli isolates from different frozen foods

如圖1所示，49 株分離株共表現為8 種耐藥譜。所有分離株至少耐受1 種所測抗生素，最常見的耐藥譜為A/C-T/S（71.4%，35/49），其次為TET-A/C-T/S（10.2%，5/49）。20.4%（10/49）的菌株為多重耐藥菌株，均至少耐受3 種所測抗生素。此外，1 株分離自蔬菜水餃的菌株對13 種抗生素表現出耐藥。

圖1 冷凍食品中大腸桿菌耐藥表型譜Fig.1 Antimicrobial resistance profile of E.coli isolates from frozen foods

對7 類抗生素耐藥相關基因檢測結果如表9所示。-內酰胺類抗性基因檢出（14.3%）、（8.2%）和（2.0%）；氨基糖苷類抗性基因檢出（8.2%）、（6.1%）、（2.0%）和（2.0%）；四環素類抗性基因檢出（12.2%）和（4.1%），未檢出；磺胺類抗性基因檢出（10.2%）、（8.2%）和（2.0%）；喹諾酮類抗性基因檢出（6.1%）、（2.0%）、（2.0%）和（2.0%）和多黏菌素類抗性基因檢出（2.0%）。此外，氯霉素類耐藥基因未檢出。

表9 大腸桿菌分離株耐藥基因檢測結果Table 9 Results of detection of resistance genes of E.coli

2.4 大腸桿菌耐藥表型與耐藥基因相關性

如圖2所示，統計49 株大腸桿菌分離菌株的耐藥表型和基因型發現，除四環素類抗生素的耐藥基因型和表型基本吻合外，其余5 類抗生素的耐藥表型和基因型不完全一致。本實驗未檢出氯霉素相關耐藥基因，但有4 株分離株對氯霉素表現為耐藥；攜帶-內酰胺類耐藥基因的菌株有9 株，但98.0%（48/49）的受試菌株對-內酰胺類抗生素表現為耐藥。

圖2 大腸桿菌耐藥表型和基因型相關性Fig.2 Correlation between antibiotic resistant phenotypes and genotypes of E.coli isolates

2.5 大腸桿菌種群分型檢測結果

如圖3所示，根據不同進化群攜帶的標志基因將大腸桿菌分為8 個進化群，本實驗中大腸桿菌分離株系統發育群分別為A群、B1群、C群和F群。其中以A群占比最多，為63.3%（31/49），其后依次為C群（18.4%，9/49）、B1群（16.3%，8/49）和F群（2.0%，1/49）。EPEC和EIEC菌株均屬于A群。冰淇淋樣品分離株全部屬于A群系，速凍水餃樣品分離株以A群（24/42）為優勢群，其次為C群（9/42）、B1群（8/42）、F群（1/42）。

圖3 大腸桿菌系統發育群Fig.3 Phylogenetic group distribution of E.coli

3 討論與結論

近年來，由大腸桿菌引發的食物安全事件層出不窮。據美國疾病控制和預防中心的數據統計顯示，2000ü 2008年間大腸桿菌導致了203 000 例食源性疾病。大腸桿菌作為食品糞便污染指標，其存在通常與不衛生、不適當的食品處理方式、交叉污染或不當的食品貯藏條件有關，是引起食源性疾病的重要原因之一。

本研究對我國陜西省4 市（寶雞、咸陽、西安和渭南）冷凍食品進行大腸桿菌監測，發現大腸桿菌檢出率為13.6%（49/360）。這一結果低于羅娟、史輝、只帥等分別對新疆、成都和陜西即食食品和零售肉類中大腸桿菌檢出率，表明低溫能一定程度限制食品中微生物的生長繁殖。方夢漁等對市場上銷售的冷凍食品進行抽樣檢測，發現21.56%的樣品中存在大腸菌群超標現象。King等曾報道因食用受大腸桿菌污染的冷凍牛肉產品，導致18 名兒童出現小兒溶血尿毒綜合征。因此，不能忽視冷凍食品中大腸桿菌的污染。速凍水餃中大腸桿菌檢出率顯著高于冰淇淋樣本，其中以肉餡（包括羊肉和豬肉）水餃的大腸桿菌檢出率最高（36.2%，34/94）。導致該結果的原因可能是由于肉餡填料的營養結構更適宜微生物的生長繁殖。所有樣品中有5 份速凍水餃樣品大腸菌群數量超過100 CFU/g。目前我國尚未對速凍水餃（生制品）中大腸菌群作出限量規定，但根據GB 19295ü2011《速凍面米制品》對速凍熟制品的要求，大腸菌群數的最高安全限量應小于100 CFU/g。速凍水餃若加熱不徹底或存在不能被加熱有效滅活的毒素（如STa），所導致的安全隱患不容忽視。STa是由ETEC產生的耐熱型腸毒素，攝入被其污染的食物將導致急性腹瀉。

對于冰淇淋樣本，便利店（5.2%，6/116）樣本大腸桿菌檢出率高于超市（0.8%，1/124），袋裝樣本（3.2%，5/156）冰淇淋的大腸桿菌檢出率高于盒裝樣本（2.4%，2/84）。這可能是由于便利店在銷售過程中的冷鏈保存環節不完善以及袋裝樣品更容易受到溫度波動的影響，導致冷凍食品的凍融引起微生物的生長繁殖。冰淇淋樣本中大腸菌群數未超過GB 2759ü2015《冷凍飲品和制作料》的限量標準，但冰淇淋作為即食食品，一些致病性強的大腸桿菌的低水平污染也可能構成重大風險。2007年比利時曾暴發一起由某農場生產銷售的冰淇淋引發的大腸桿菌感染事件，涉及12 人感染。綜上，冷凍食品中大腸桿菌的污染對消費者的健康具有潛在威脅。

大腸桿菌的致病能力與其攜帶的毒力因子密切相關。本研究發現分離株的ExPEC相關基因檢出率較高，包括鐵轉運相關基因（、、、）、黏附基因（、）和抗血清存活因子相關基因。已有研究證明鐵轉運基因能夠顯著增強大腸桿菌在宿主體內的存活能力，Aslam等從冷凍肉中分離的大腸桿菌中和基因檢出率較高，與本研究結果一致，推測攝鐵能力可能增強大腸桿菌對低溫條件的抵抗能力。此外，在本研究中與常同時存在于1 株菌中，是耶爾森菌強毒力島標志基因，能夠在幾乎所有攜帶的大腸桿菌中表達，增強大腸桿菌的致病性。國外相關研究已將鐵載體合成基因（、）作為鑒定ExPEC菌株的參考指標之一。本次調查也證實了本地區冷凍食品存在ExPEC污染的風險。此外，根據和這2 種特異性基因，DEC分離株被區分為EPEC（8.2%，4/49）和EIEC（4.1%，2/49）。付宇和Lima等報道食源致病性大腸桿菌主要以EPEC和EIEC為主。EPEC是發展中國家嬰兒腹瀉的主要原因；EIEC與志賀氏菌屬密切相關，可引起人類細菌性痢疾。由于冰淇淋在食用前無需加熱，其中致病性大腸桿菌的檢出意味著對消費者的健康構成潛在威脅。結果還顯示，來自肉餡速凍水餃的大腸桿菌的毒力基因攜帶率較高（30.6%，15/49）。這一結果與Badri和Badi等對動物源食品中攜帶毒力基因的大腸桿菌檢出率相似。這表明動物源食品可能是引起相關食源性疾病的主要載體，受污染的生肉或未煮熟的肉類在食源性病原體的傳播過程中尤為重要。

本研究中大腸桿菌分離株對阿莫西林/克拉維酸、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、四環素和氨芐西林的耐藥率較高。歐洲食品安全局報告稱，-內酰胺類抗生素、四環素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑是食品中大腸桿菌多重耐藥模式中最常見的抗生素，這些抗生素的高耐藥率可能與其在畜牧業和人類中的普遍使用有關，導致耐藥率較高。本研究中DEC菌株至少耐受1 種所測抗生素。耐藥致病性大腸桿菌對食品的污染，尤其是即食食品，會對消費者的健康構成威脅。這些菌株可能在腸道內將抗性基因轉移給其他病原微生物或共生細菌，從而導致選擇或使用合適的治療方法變得困難。一株分離自蔬菜水餃的菌株對13 種抗生素表現出耐藥，其屬于B1群系。速凍水餃生產工藝復雜，大腸桿菌的污染可能發生在食品生產鏈的多個環節，包括原料、加工、銷售等。動物源大腸桿菌優勢群系為B1群系，人源大腸桿菌優勢群系為B2群。Araújo等也曾報道有機肥的使用導致來自蔬菜的菌株具有較高的多重耐藥水平。因此推測是原料受到來自動物源多重耐藥大腸桿菌污染。研究結果還顯示耐藥菌株的表型和基因型并不完全一致。大腸桿菌對阿莫西林/克拉維酸的耐藥性通常由介導，與Karmele等報道不同的是，本研究中僅有1 株對阿莫西林/克拉維酸耐藥的菌株攜帶基因。這表明可能存在其他因素介導菌株產生耐藥性。目前，普遍認為主動外排作用是細菌產生耐藥性的主要機制，Kumar等報道大腸桿菌中的抗性結節細胞分離超家族能夠促使大腸桿菌主動外排氯霉素、-內酰胺類、四環素等抗生素。因此，分離菌株耐藥但不攜帶耐藥基因可能是由于大腸桿菌能夠通過主動外排泵將藥物從菌體內排出；而敏感菌株攜帶耐藥基因則可能是耐藥基因或相關酶活性被抑制。此外，從速凍水餃樣品中分離得到1 株攜帶的菌株，但對多黏菌素并未表現出耐藥性。多黏菌素目前用于治療人類和家畜由多重耐藥病原體引起的感染，是一種重要的抗生素。能夠降低大腸桿菌對多黏菌素的敏感性，被多黏菌素誘導表達產生耐藥性，需要嚴格監測其潛在傳播。基因通常位于質粒，能夠在細菌間進行快速轉移。需考慮到食源性大腸桿菌耐藥基因可能通過食物鏈傳遞給人類嚴重威脅人體健康。

本研究確定了從冷凍食品中分離的49 株大腸桿菌分離菌株系統發育群，優勢群系為A群系，其次為C群。Koo等報道了食源性大腸桿菌大多屬于A和B1群，與本研究中分離菌株多屬于A和C群系的結果存在差異，出現這種差異的原因是A和C群具有高度相關性，在三重基因型劃分系統發育群中常一同被歸類為A群。已有報道稱大腸桿菌的系統發育群與毒力及致病性之間存在相關性。Duriez等研究表明腸道致病型及共生型大腸桿菌優勢群系為A、B1或D，其攜帶毒力基因較少，致病能力較弱；ExPEC多屬于B2和D組。這與本實驗中DEC菌株優勢群系為A群的結果相符。但本實驗結果中多重耐藥性及攜帶毒力基因的菌株多屬于A和B1群，且基因是B1群菌株中觀察到的最常見基因，其能夠增強菌株引起感染的能力。因此需要重視A和B1群系對公共健康的影響。同時本實驗還分離出1 株F群系多重耐藥菌株，該群系與B2群具有高度相關性和幾乎相當的致病潛力。該菌株攜帶4 個ExPEC相關基因，增強了其在腸道外引起感染的能力，目前已有研究報道F群系菌株可能引起尿路感染。

通過對陜西省冷凍食品大腸桿菌的監測，結果表明預包裝冷凍食品不可避免存在大腸桿菌的污染風險。本研究調查發現冷凍食品中分離得到EPEC和EIEC的菌株，且存在ExPEC菌株污染的風險。因此，為防止大腸桿菌對冷凍食品的污染，食品加工、運輸和貯藏環境需要加以改善。此外，對動物養殖過程中抗生素的使用加以干預，對于防止細菌抗生素耐藥性的傳播十分必要。由于食品生產鏈中存在來自環境和人類的交叉污染，需要進一步的流行病學研究，以確定不同食品生產環節的潛在污染源。