石菖蒲根莖化學成分及抗炎活性研究

邱路雅，楊 剛，金 瓊，羅曉東，劉亞平3, ，王易芬

石菖蒲根莖化學成分及抗炎活性研究

邱路雅1, 4，楊 剛1, 4，金 瓊4，羅曉東4，劉亞平3, 4*，王易芬1, 2*

1. 云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500 2. 中國科學院昆明動物物研究所，云南 昆明 650201 3. 昆明理工大學食品科學與工程學院，云南 昆明 650500 4. 中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201

對石菖蒲干燥根莖的化學成分及其抗炎活性進行研究。采用硅膠、YMC、Sephadex LH-20等多種柱色譜填料進行分離純化，根據理化性質結合波譜數據鑒定化合物結構。通過檢測脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的RAW 264.7巨噬細胞中白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）炎癥因子的表達和一氧化氮（NO）的抑制能力，來評估所分離化合物的抗炎作用。從石菖蒲中分離得到18個單體化合物，包括9個苯丙素類、4個酚類、2個木脂素類、1個倍半萜、1個甾體及1個其他類型化合物，分別鑒定為原兒茶醛（1）、3,5-二甲氧基-4-羥基苯丙酮（2）、4-(乙氧基甲基)苯酚（3）、(2)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸戊酯（4）、反式-阿魏酸二十二烷基酯（5）、反式-阿魏酸二十烷基酯（6）、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯（7）、3-(2-甲氧基乙基)苯酚（8）、反式松柏醛（9）、對甲氧基苯酚（10）、β-細辛醚（11）、α-細辛醚（12）、2-乙酰基-菖蒲烯酮（13）、對羥基苯甲酸（14）、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸（15）、(?)-丁香樹脂（16）、(?)-松脂醇（17）、胡蘿卜苷（18）。化合物2～9均為首次從該屬植物中分離獲得。此外，單體化合物的抗炎活性與陽性對照組地塞米松比較，化合物1～4、6～12、14～16在20 μg/mL質量濃度下能顯著降低LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞中IL-6、IL-1β、TNF-α炎性細胞因子分泌和NO的釋放，具有較好的體外抗炎作用。

石菖蒲；抗炎活性；炎癥因子；3,5-二甲氧基-4-羥基苯丙酮；4-(乙氧基甲基)苯酚；反式松柏醛

石菖蒲Schott為天南星科（Araceae）菖蒲屬L.植物。全國各省區均產，其干燥根莖被《中國藥典》2020年版收錄具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃的功效，用于治療痰涎壅閉、神識不清、腹脹腹痛、食欲不振、風寒濕痹等癥[1-2]。現代藥理研究表明，石菖蒲根莖具有顯著的抗炎、免疫抑制、抗真菌、抗抑郁等作用[3-4]，其主要化學成分為苯丙素、倍半萜、木脂素、生物堿、萜類和甾體、多糖等[5-6]。為進一步揭示石菖蒲根莖的化學成分，研究豐富該植物的化學多樣性，本實驗從石菖蒲干燥根莖中分離獲得了18個單體化合物，通過核磁共振、質譜等手段分別鑒定為原兒茶醛（protocatechualdehyde，1）、3,5-二甲氧基-4-羥基苯丙酮（3,5-dimethoxy-4-hydroxypropiophenone，2）、4-(乙氧基甲基)苯酚 [4-(ethoxymethyl) phenol，3]、(2)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸戊酯 [pentyl (2)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2- propenoate，4]、反式-阿魏酸二十二烷基酯（-ferulic acid docosyl ester，5）、反式-阿魏酸二十烷基酯（-ferulic acid eicosyl ester，6）、4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯（4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid ethyl ester，7）、3-(2-甲氧基乙基)苯酚 [3-(2- methoxyethyl)phenol，8]、反式松柏醛（-coniferyl aldehyde，9）、對甲氧基苯酚（4-methoxyphenol，10）、β-細辛醚（β-asarone，11）、α-細辛醚（α-asarone，12）、2-乙酰基-菖蒲烯酮（2-acetoxyacorenone，13）、對羥基苯甲酸（-hydroxybenzoic acid，14）、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸（5,8,11,14,17-eicosapen- taenoic acid，15）、(?)-丁香樹脂 [(?)-syringaresinol，16]、(?)-松脂醇 [(?)-pinoresinol，17]、胡蘿卜苷（daucosterol，18）。其中，化合物2、4～9、11～12為苯丙素類化合物，化合物1、3、10、14為酚類化合物，化合物16、17為木脂素類化合物，化合物13為倍半萜，化合物18為甾體類化合物，化合物15為其他類型化合物，化合物2～9為首次從該屬中分離得到。利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的RAW 264.7巨噬細胞評估了18個單體化合物的體外抗炎活性，結果表明，與陽性對照組地塞米松（dexamethasone，DXM）比較，化合物1～4、6～12、14～16在20 μg/mL能顯著降低LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞中白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）炎癥因子分泌和NO的釋放，具有潛在的體外抗炎作用。

1 儀器與材料

1290 UPLC/6540 Q-TOF串聯四極桿飛行時間質譜儀（美國Agiletn公司），Bruker AVANCE-III（400、500、600 MHz）型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），Waters 600半制備型高效液相色色譜儀和Shimadzu SIL-20A制備型HPLC，兩者均為雙波長紫外檢測器，色譜柱為COSMOSILRP-C18（250 mm×10 mm，5 μm，COSMOSIL，日本）及Ultimate XB-C18（250 mm×10 mm，5 μm，Welch，上海月旭），MCI-凝膠（75～150 μm，日本三菱化學公司），YMC-凝膠（50 μm，日本YMC有限公司），Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（40～150 μm，瑞典烏樸薩拉Amersham Pharmacia Biotech AB公司），反相常壓和中壓填充材料為Lichroprep RP-18（40～63 μm，德國達姆施塔特Merck公司），拌樣硅膠及柱色譜色譜硅膠（200～300目，青島譜科分離材料有限公司）。LPS（Solarbio公司，中國北京），磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、Eagle培養基（DMEM）（Servicebio Technology，中國武漢）。NO試劑盒（南京建成生物工程研究所），MTT（Sigma-Aldrich公司，中國上海），TNF-α、IL-6和IL-1β試劑盒（MultiSciences Biotech公司，中國杭州）。地塞米松（批號D1001A，大連美侖生物技術有限公司），甲醇和乙腈（色譜純，美國Fisher公司），其余工業級別試劑均為重蒸后使用。

實驗用石菖蒲于2020年11月購買于云南省昆明市菊花村藥材市場，植物由昆明理工大學劉亞平副研究員鑒定為石菖蒲Schott的干燥根莖，目前植物標本（Liu20201103）存放于中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部資源可持續利用國家重點實驗室。

2 方法

2.1 提取與分離

石菖蒲干燥根莖1 kg，粉碎后加入90%甲醇水溶液，先冷浸12 h，然后加熱（60 ℃左右）回流提取4次，每次約3 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮得粗提物浸膏約200 g。將浸膏用適量水混懸分散，加入適量的醋酸乙酯，萃取3次，將得到醋酸乙酯部分濃縮得到浸膏19 g。硅膠拌樣后經硅膠柱色譜粗分，以氯仿-甲醇（1∶0～1∶1）進行梯度洗脫，TLC檢測分為4個流分（Fr A～D）。

Fr A（2.7 g）在MCI柱上分離，用甲醇-水（70∶30→100∶0）梯度洗脫后，經TLC檢識合并再經過硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（30∶1）等度洗脫得到化合物15（12 mg）。

Fr B（7 g）通過正相硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（15∶1→1∶1）梯度洗脫，TLC檢測流分，合并得到3個亞組分Fr B-1～B-3。其中Fr B-1（2.6 g）經中壓液相色譜甲醇-水（40∶60→100∶0）梯度洗脫后得到化合物4（32 mg）和3（5 mg），再經半制備型高效液相色譜純化得到化合物10（20 mg，R＝15.5 min；乙腈-水55∶45，3.0 mL/min），和14（30 mg，R＝25.5 min；乙腈-水55∶45，3.0 mL/min）。Fr B-2（580 mg）經制備型高效液相色譜洗脫得到化合物5（25 mg，R＝15.5 min；乙腈-水70∶30，3.0 mL/min）和6（68 mg，R＝18 min；乙腈-水70∶30，3.0 mL/min）。Fr B-3（560 mg）采用正相硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（15∶1→10∶1）梯度洗脫得到化合物13（3.2 mg）和8（13 mg）。

Fr C（3 g）經反相材料YMC柱色譜加壓分離，然后用甲醇-水（40∶60→100∶0）梯度洗脫，得到4個亞組分Fr C-1～C-4。亞組分Fr C-2（1.4 g）通過正相硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（9∶1→3∶1）梯度洗脫獲得化合物7（12 mg）和9（7 mg）。亞組分Fr C-3（600 mg）在硅膠柱分離，氯仿-甲醇（9∶1→3∶1）梯度洗脫后，再經半制備高效液相純化得到化合物11（20 mg，R＝15.5 min；乙腈-水65∶35，3.0 mL /min）、12（30 mg，R＝25.5 min；乙腈- 水65∶35，3.0 mL/min）。

Fr D（2 g）經Sephadex LH-20柱氯仿-甲醇（1∶1）分離，TLC檢測合并得到2個亞組分Fr D-1和Fr D-2，Fr D-1（1.3 g）采用正相硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（8∶1→3∶1）梯度洗脫得到化合物1（6.6 mg）、2（19.3 mg）和混合溶液，后者溶劑揮發過程中產生晶體，經過多次溶劑洗滌，重結晶得到化合物18（105 mg）。Fr D-2（200 mg）半制備型高效液相色譜純化得到化合物16（13 mg，R＝16.5 min；乙腈-水43∶67，3.0 mL/min）、17（65 mg，R＝20 min；乙腈-水43∶67，3.0 mL/min）。

2.2 體外抗炎活性評價

根據文獻報道的方法[7]，設置對照組、LPS組、陽性對照DEX組和實驗組。將RAW 264.7巨噬細胞以1×105個細胞/mL的密度接種在96孔板中，并在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h。DEX和待測化合物1～18以20 μg/mL質量濃度加入到處理好的96孔板中。4 h后，空白對照組加入10 μL培養基，LPS組、DEX組、實驗組加入LPS（1.0 μg/mL）孵育22 h，離心5 min，收集細胞上清液。用于測定炎癥因子的相關指標：NO、IL-6、IL-1β、TNF-α。通過酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測定NO介質的釋放量和炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表達量。應用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測化合物在20 μg/mL對RAW 264.7巨噬細胞生長狀況的影響。

實驗數據采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析，計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析法；顯著性差異用檢驗來確定。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末，ESI-MS/: 139 [M＋H]+，分子式為C7H6O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 9.70 (1H, s, -CHO), 7.26 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.90 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.90 (1H, s, H-2);13C-NMR (125 MHz, DMSO-d): 191.1 (C-7), 152.2 (C-4), 145.9 (C-3), 128.8 (C-6), 124.5 (C-1), 115.5 (C-5), 114.3 (C-2), 以上數據經查閱文獻報道[8]，鑒定化合物1為原兒茶醛。

化合物2：白色粉末，ESI-MS/: 211 [M＋H]+，分子式為C11H14O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 9.21 (1H, s, 4-OH), 7.22 (2H, s, H-2, 6), 3.81 (6H, s, 3, 5-OCH3), 3.22 (2H, m, H-8), 1.07 (3H, t,= 2.3 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d): 200.1 (C-7), 148.8 (C-3, 5), 141.9 (C-4), 128.3 (C-1), 107.1 (C-2, 6), 57.3 (3, 5-OCH3), 31.9 (C-8), 9.8 (C-9)，以上數據經查閱文獻報道[9]，鑒定化合物2為3,5-二甲氧基-4-羥基苯丙酮。

化合物3：白色粉末，ESI-MS/: 137 [M－H]?，分子式為C8H10O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.10 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2, 6), 6.73 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3, 5), 4.25 (2H, s, H-7), 3.45 (3H, s, 8-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 156.8 (C-4), 129.3 (C-3, 5), 128.4 (C-1), 115.9 (C-2, 6), 73.5 (C-7), 57.7 (8-OCH3)。以上數據經查閱文獻報道[10]，鑒定化合物3為4-(乙氧基甲基) 苯酚。

化合物4：白色粉末，ESI-MS/: 263 [M－H]?，分子式為C15H20O4。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.61 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.25 (1H, s, H-2), 7.05 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.91 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.28 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 4.23 (2H, t,= 7.2 Hz, H-10), 3.92 (3H, s, 3-OCH3), 1.70 (2H, m, H-11), 1.36 (4H, m, H-12, 13), 0.88 (3H, t,= 7.2 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 167.5 (C=O), 148.1 (C-3), 144.8 (C-4), 143.9 (C-7), 127.2 (C-1), 123.2 (C-6), 115.9 (C-5), 114.5 (C-8), 109.4 (C-2), 60.5 (C-10), 56.1 (3-OCH3), 29.9 (C-11, 12, 13), 14.5 (C-14)。以上數據經查閱文獻報道[11]，鑒定化合物4為(2)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸戊酯。

化合物5：白色粉末，ESI-MS/: 501 [M－H]?，分子式為C32H54O4。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.53 (1H, d,= 15.6 Hz, H-7), 6.98 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd,= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.83 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.21 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 5.88 (1H, s, 4-OH), 4.11 (2H, t,= 6.8 Hz, H-1′), 3.82 (3H, s, 3-OCH3), 1.62 (2H, d,= 6.7 Hz, H-2′), 1.17 (38H, m, H-3′～21′), 0.80 (3H, t,= 6.8 Hz, H-22′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 167.4 (C=O), 147.9 (C-4), 146.8 (C-3), 144.7 (C-7), 127.5 (C-1), 123.8 (C-6), 115.6 (C-8), 114.7 (C-5), 109.3 (C-2), 64.6 (C-1′), 55.8 (3-OCH3), 31.9 (C-2′), 22.7～29.7 (C-3′～21′), 14.1 (C-22′)，以上數據經查閱文獻報道[12]，鑒定化合物5為反式-阿魏酸二十二烷基酯。

化合物6：白色粉末，ESI-MS/: 473 [M－H]?，分子式為C30H50O4。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.70 (1H, d,= 14.0 Hz, H-7), 7.03 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 7.04 (1H, dd,= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.95 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.72 (1H, d, J=14.0 Hz, H-8), 5.79 (1H, s, 4-OH), 4.06 (2H, t,= 8.0 Hz, H-1'), 3.56 (3H, s, 3-OCH3), 1.70 (2H, m, H-2′), 1.19 (34H, m, H-3′～19′), 0.88 (3H, m, H-20′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 161.9 (C=O), 142.1 (C-4), 141.1 (C-3), 138.8 (C-7), 122.5 (C-1), 120.8 (C-6), 112.1 (C-5), 109.5 (C-8), 108.0 (C-2), 59.7 (C-1′), 58.3 (3-OCH3), 22.1～29.9 (C-3′～19′), 14.5 (C-20′)，以上數據經查閱文獻報道[13]，鑒定化合物6為反式-阿魏酸二十烷基酯。

化合物7：白色粉末，ESI-MS/: 223 [M－H]?，分子式為C12H14O4。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.61 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.25 (1H, s, H-2), 7.05 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.91 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.28 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 4.23 (2H, q,= 7.2 Hz, H-10), 3.92 (3H, s, 3-OCH3), 1.34 (3H, t,= 7.2 Hz, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 167.5 (C=O), 148.1 (C-3), 146.8 (C-4), 144.9 (C-7), 127.2 (C-1), 123.2 (C-6), 115.8 (C-5), 114.8 (C-8), 109.8 (C-2), 60.5 (C-10), 56.1 (3-OCH3), 14.4 (C-11)。以上數據經查閱文獻[14]，鑒定化合物7為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯。

化合物8：白色粉末，ESI-MS/: 151 [M－H]?，分子式為C9H12O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.78 (1H, t,= 8.0 Hz, H-5), 7.21 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4), 6.81 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.80 (1H, s, H-2), 4.37 (2H, m, H-8), 3.43 (2H, m, H-7), 3.36 (3H, s, 8-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 155.4 (C-3), 139.0 (C-1), 130.1 (C-4), 129.6 (C-6), 115.2 (C-2, 5), 74.4 (C-8), 57.7 (8-OCH3), 50.8 (C-7)。以上經查閱文獻報道[15]，鑒定化合物8為對3-(2-甲氧基乙基)苯酚。

化合物9：白色粉末，ESI-MS/: 177 [M－H]?，分子式為C10H10O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 9.66 (1H, d,= 8.0 Hz, H-9), 7.42 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.26 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 7.07 (1H, dd,= 8.4, 1.2 Hz, H-6), 6.96 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 6.62 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 3.95 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d): 193.8 (C=O), 153.2 (C-7), 149.1 (C-3), 147.1 (C-4), 126.8 (C-1), 126.6 (C-8), 124.2 (C-6), 115.1 (C-5), 109.6 (C-2), 56.2 (3-OCH3)，以上數據經查閱文獻報道[16]，鑒定化合物9為反式松柏醛。

化合物10：白色粉末，ESI-MS/: 123 [M－H]?，分子式為C7H8O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 9.37 (1H, s, 1-OH), 7.08 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.70 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 3.36 (3H, s, 4-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d): 156.8 (C-4), 129.8 (C-2, 6), 128.4 (C-1), 115.9 (C-3, 5), 57.7 (1-OCH3)，以上數據經查閱文獻報道[17]，鑒定化合物10為對甲氧基苯酚。

化合物11：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 209 [M＋H]+，分子式為C12H16O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.83 (1H, s, H-6), 6.68 (1H, d,= 11.6 Hz, H-1′), 6.50 (1H, s, H-3), 5.80 (1H, dd,= 11.6, 6.8 Hz, H-2′), 3.88 (3H, s, 2-OCH3), 3.83 (3H, s, 4-OCH3), 3.80 (3H, s, 5-OCH3), 1.84 (3H, d,= 6.8 Hz, H-3′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 150.7 (C-4), 148.5 (C-2), 142.4 (C-1), 125.8 (C-1′), 124.8 (C-2′), 118.1 (C-5), 114.1 (C-6), 97.5 (C-3), 56.6 (2-OCH3), 56.4 (4-OCH3), 56.1 (5-OCH3), 14.5 (C-3′)。以上數據經查閱文獻報道[18]，鑒定化合物11為β-細辛醚。

化合物12：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 209 [M＋H]+，分子式為C12H16O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.93 (1H, s, H-6), 6.71 (1H, d,= 16.0 Hz, H-1′), 6.50 (1H, s, H-3), 6.10 (1H, dd,= 6.6, 16.0 Hz, H-2′), 3.88 (3H, s, 2-OCH3), 3.85 (3H, s, 4-OCH3), 3.81 (3H, s, 5-OCH3), 1.89 (3H, d,= 6.6 Hz, H-3′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 150.6 (C-4), 148.7 (C-2), 143.4 (C-1), 125.0 (C-1′), 124.4 (C-2′), 118.9 (C-5), 109.7 (C-6), 97.9 (C-3), 56.7 (2-OCH3), 56.4 (4-OCH3), 56.1 (5-OCH3), 18.8 (C-3′)。以上數據經查閱文獻報道[19]，鑒定化合物12為α-細辛醚。

化合物13：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 279 [M＋H]+，分子式為C17H26O3，1H NMR (400 MHz, CDCl3): 6.33 (1H, d,= 2.4 Hz, H-9), 5.14 (1H, dd,=2.4, 6.1 Hz, H-2), 2.90 (1H, dd,= 2.4, 18.6 Hz, H-10a), 2.86 (1H, dd,= 6.1, 18.6 Hz, H-10b), 2.55 (2H, s, H-6), 2.22 (1H, ddd,= 6.5, 8.9, 14.6 Hz, H-3), 2.02 (3H, s, COCH3), 1.76 (3H, s, H-14), 1.06 (3H, d,= 6.2 Hz, H-12), 1.00 (3H, d,= 6.2 Hz, H-13), 0.89 (3H, d,= 7.1 Hz, H-15)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 200.4 (C-7), 170.6 (C=O), 144.2 (C-9), 135.1 (C-8), 76.4 (C-2), 60.1 (C-1), 47.6 (C-5), 46.5 (C-6), 39.8 (C-3), 39.4 (C-10), 39.1 (C-4), 25.4 (C-11), 21.4 (C-12, 13), 18.1 (C-15), 15.7 (C-14)。以上數據經查閱文獻報道[20]，鑒定化合物13為2-乙酰基-菖蒲烯酮。

化合物14：白色粉末，ESI-MS/: 151 [M－H]?，分子式為C7H6O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.95 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3, 5), 6.86 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2, 6)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 167.1 (COOH), 159.9 (C-4), 132.1 (C-2, 6), 122.9 (C-1), 115.4 (C-3, 5)，以上數據經查閱文獻報道[21-22]，鑒定化合物14為對羥基苯甲酸。

化合物15：無色透明油狀物，ESI-MS/: 303 [M＋H]+，分子式為C20H30O2，主要碎片峰分別為267 [M－O2H4＋H]+, 233 [M－C5H10＋H]+, 155 [M－C11H16＋H]+, 151 [M－C9H12O2＋H]+，數據與文獻基本一致[23-24]。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 5.30～5.50 (10H, m, H-5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18), 2.79 (8H, m, H-7, 10, 13, 16), 2.10 (2H, m, H-19), 1.90 (2H, t,= 2.4 Hz, H-2)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 168.1 (C-1), 127.1～131.9 (C-5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18), 29.3～31.5 (C-7, 10, 13, 16), 25.6～27.1 (C-2, 3, 4, 19), 14.1 (C-20)。以上數據經查閱文獻報道[25]，鑒定化合物15為5,8,11,14,17-二十碳五烯酸。

化合物16：白色粉末，[α]20 D–13.33 (0.06, MeOH)，ESI-MS/: 417 [M－H]?，分子式為C22H26O8。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.60 (4H, s, H-2, 6, 2′, 6′), 4.62 (2H, d,= 2.0 Hz, H-7, 7′), 4.17 (4H, m, H-9, 9′), 3.76 (12H, s, 3, 5, 3′, 5′-OCH3), 3.06 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 147.9 (C-3, 5, 3′, 5′), 134.8 (C-4, 4′), 131.5 (C-1, 1′), 103.6 (C-2, 6, 2′, 6′), 85.6 (C-7, 7′), 71.1 (C-9, 9′), 56.0 (3, 5, 3′, 5′-OCH3), 53.7 (C-8, 8′)。以上數據經查閱文獻報道[26]，鑒定化合物16為(?)-丁香樹脂。

化合物17：白色粉末，[α]20 D–9.40 (0.10, MeOH)，ESI-MS/: 357 [M－H]?，分子式為C20H22O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.60～6.86 (6H, m, H-2, 5, 6, 2′, 5′, 6′), 4.74 (2H, d,= 3.6 Hz, H-7, 7′), 4.07 (4H, m, H-9, 9′), 3.73 (6H, s, 3, 3′-OCH3), 3.01 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 147.5 (C-3, 3′), 145.9 (C-4, 4′), 131.5 (C-1, 1′), 118.6 (C-2, 2′), 115.1 (C-5, 5′), 110.4 (C-6, 6′), 85.2 (C-7, 7′), 71.0 (C-9, 9′), 55.6 (3, 3′-OCH3), 53.6 (C-8, 8′)。以上數據經查閱文獻報道[27]，鑒定化合物17為(?)-松脂醇。

化合物18：白色粉末, ESI-MS/: 577 [M＋H]+，分子式為C35H60O6。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 5.34 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6), 4.42 (1H, m, H-3), 4.22 (1H,= 10.5 Hz, Glu H-1′), 3.09～4.20 (5H, m, Glu H-2′～6′), 0.77～0.99 (12H, m, 4×CH3), 0.65 (3H, d,= 4.2 Hz, CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 140.4 (C-5), 121.2 (C-6), 100.8 (C-1′), 78.7 (C-3), 76.9 (C-3′), 76.7 (C-5′), 73.5 (C-2′), 70.1 (C-4′), 61.1 (C-6′), 56.2 (C-14), 55.1 (C-17), 49.6 (C-9), 45.1 (C-24), 41.8 (C-13), 40.1 (C-12), 38.3 (C-4), 36.9 (C-1), 36.6 (C-10), 35.5 (C-20), 33.3 (C-22), 31.4 (C-7), 31.3 (C-8), 29.3 (C-2), 28.7 (C-25), 27.8 (C-16), 25.4 (C-23), 23.9 (C-15), 22.6 (C-28), 20.6 (C-11), 19.7 (C-27), 19.1 (C-19), 18.9 (C-26), 18.6 (C-21), 11.7 (C-29), 11.5 (C-18)。以上數據通過與文獻報道[28]比對，鑒定化合物18為胡蘿卜苷。

4 抗炎活性篩選

通過檢測單體化合物1～18對LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞中炎癥因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的分泌以及NO的釋放來評價其抗炎活性，結果見圖1。DEX為陽性對照組，對照組只有RAW 264.7巨噬細胞沒有添加LPS，細胞存活率測試結果表明，化合物在20 μg/mL質量濃度及不添加LPS情況下，均對RAW264.7巨噬細胞的生長狀況沒有任何影響。但是在RAW264.7巨噬細胞中添加LPS后，與對照組相比，IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥因子的含量，NO的產生顯著增加（＜0.05）。與LPS組相比較，大多數化合物在20 μg/mL質量濃度時能明顯地減少炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌，抑制NO的產生（＜0.05）。與DEX組相比較，除化合物4～6外，其他化合物在20 μg/mL下能較好的抑制NO的釋放；此外，與陽性對照組（DXM組）相比，化合物1～16、18對炎癥因子IL-6呈現了更好的抑制效果。同樣的，在20 μg/mL質量濃度下，化合物1～4、6～10、11～16、18對炎癥因子IL-1β展現了更好的抑制率，在相同質量濃度下，化合物1、2、8、14、15也能較好地抑制TNF-α的分泌。

與對照組比較#P＜0.05；與LPS組比較?P＜0.05

5 討論

本實驗對石菖蒲干燥根莖的醋酸乙酯部位進行化學成分研究，從中分離并鑒定了18個化合物，包括9個苯丙素類、4個酚類、2個木脂素類、1個倍半萜、1個甾體及1個其他類型化合物，其中化合物2～9為首次從該屬中分離得到。體外抗炎活性表明，大多數化合物在20 μg/mL時明顯地減少了LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中炎癥因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的分泌和NO介質的含量（＜0.05）。與陽性對照藥相比較，部分化合物能顯著降低LPS誘導的RAW 264.7細胞中炎癥因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表達，抑制NO的合成，具有較好體外抗炎作用。

綜上所述，本實驗豐富了石菖蒲根莖化合物化學和藥理活性的研究，實驗結果進一步驗證了石菖蒲根莖的傳統應用，闡釋了其發揮抗炎活性的物質基礎，為該著名中藥材的未來開發應用提供一定的理論依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents from rhizoma ofits anti-inflammatory activity

QIU Lu-ya1, 4, YANG Gang1, 4, JIN Qiong4, LUO Xiao-dong4, LIU Ya-ping3, 4, WANG Yi-fen1, 2

1. School of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China 3. Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 4. State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China

To study the chemical compositions and their anti-inflammatory activities from the dried rhizoma of.The ethyl acetate layer ofwas phytochemically investigated by multiple step chromatography techniques, such as silica gel, YMC, Sephadex LH-20 gel and other column chromatography techniques. The structures of these isolates were unambiguously elucidated by means of extensive spectroscopic and comparison with corresponding data of the reported literature. All the isolated compounds were evaluated for their anti-inflammatory effects via detecting inflammatory mediator releases (IL-6、IL-1β、TNF-α) and NO medium level in RAW 264.7 macrophage cells induced by lipopolysaccharide (LPS).A total of 18 compounds, isolated from ethyl acetate layer of, were identified as protocatechualdehyde (1), 3,5-dimethoxy-4-hydroxypropiophenone (2), 4-(ethoxymethyl) phenol (3), pentyl (2)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2- propenoate (4),-ferulic acid docosyl ester (5),-ferulic acid eicosyl ester (6), 4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid ethyl ester (7), 3-(2-methoxyethyl)phenol (8),-coniferyl aldehyde (9), 4-methoxyphenol (10), β-asarone (11), α-asarone (12), 2-acetoxyacorenone (13),-hydroxybenzoic acid (14), 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (15), (-)-syringaresinol (16), (-)-pinoresinol (17) and daucosterol (18).Among all the isolates, compounds 2—9 are isolated fromspecies for the first time. Furthermore, compounds 1—4, 6—12, 14—16 could remarkably inhibited the secretion of inflammatory mediators (IL-6、IL-1β、TNF-α) and NO medium level in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages cells at the concentration of 20 μg/mL, comparable to DXM used as the positive control. All the results suggested thatpossessed the anti-inflammatory activity.+

Schott; anti-inflammatory activity; LPS induction; inflammatory factors; 3,5-dimethoxy-4-hydroxy- propiophenone; 4-(ethoxymethyl) phenol;-coniferyl aldehyde

R284.1

A

0253 - 2670(2022)15 - 4617 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.004

2022-02-28

國家自然科學基金資助項目（31872676）；云南省應用基礎研究面上項目（202101AT070436）

邱路雅（1997—），女，在讀碩士，專業方向為中藥質量控制與評價。E-mail: 1229093782@qq.com

通信作者：王易芬，博士，副研究員，研究方向為植物化學與物質資源。E-mail: wangyifen@mail.kiz.ac.cn

劉亞平，博士，副教授，研究方向為植物化學與物質資源。E-mail: liuyaping@kust.edu.cn

[責任編輯 王文倩]